Bu protokol, araştırmacıların nöronal bağlantı kalıpları ve bir devre içinde işlevin temelini alan mekansal organizasyon hakkında önemli soruları yanıtlamasına izin verecektir. Bu tekniğin temel avantajı, bozulmamış üç boyutlu dokunun derinliklerinde bulunan nöronal morfolojilerin görselleştirilmesini mümkün hale getirmedir. Bu yöntem basittir ve böylece kolayca tekrarlanabilir.
İlk kez deney yapanlar bu tekniği yaparken rahat olmalıdır. Yüksek kaliteli veri elde etmek için net bir doku örneğine sahip olmak zorunludur. Uygun doku netliği ve temizleme tekniklerinin görsel gösterimi kolayca tekrarlanabilir sonuçlar sağlayacaktır.
Başlamak için, hidrojel batırılmış beyin dokusunu eksi 90 kilopaskal vakumla 37 santigrat derecede üç saat boyunca bir vakum inkübatörüne yerleştirin. Vakumun düzgün oluşmasını sağlamak için tüp üstünü sökülmüş olarak bırakın. Pbs ile dokuyu oda sıcaklığında 10 dakika hafif sallayarak yıkayın.
Polimerize doku örneğini, oda içindeki dokunun yönünü takip derek elektroforeis odasına yerleştirin. Hazneyi ve hazneyi birlikte verilen elektroforez SDS tamponu ile doldurun. Örneği 70 volt, bir amper ve 35 santigrat derecede, mililitre doku başına yaklaşık iki saat boyunca sabit akımla çalıştırın.
Örneği odadan çıkarıp aynı yönde değiştirerek beyin dokusunun yeterli temizlenmesi için periyodik olarak kontrol edin. Numune temizlemeyi bitirdikten sonra, PBS'yi oda sıcaklığında bir gece boyunca PBS'de yıkayın ve PBS'yi mümkün olduğunca sık taze PBS ile değiştirin. PBS'deki son yıkamayı takiben, dokuyu oda sıcaklığında beş dakika boyunca deiyonize suda üç kez yıkayın.
Doku opak hale gelecek ve genişleyebilir. Refraktif indeks eşleştirme çözeltislerindeki dokuyu oda sıcaklığında en az dört saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, numuneyi görüntülemek için uygun bir muhafaza odası inşa edin.
Montaj için bir taban olarak cam bir slayt kullanarak başlayın, ardından kauçuk veya plastik ara parçaları yatırın ve herhangi bir delik olmadığından emin olarak süper tutkalla sabitleyin. Şeffaf dokuyu, kırılma indisi eşleştirme çözeltisi ile önceden doldurulmuş montaj odasına yerleştirin. Üzerine cam bir kapak kılıfı yerleştirip oje ile kapatarak dokuyu güvenli bir şekilde monte edin.
Bu dokuyu, doğrudan camın üzerine bir damla kırma indeksi eşleştirme montaj çözeltisi ekleyerek görüntüleyin. Beş milimetreden fazla kalınlıkta dokular için büyük bir doku görüntüleme odası oluşturmak için, yüksek duvarlı 10 santimetrelik bir cam tabak kullanın. Tüpün çapının kullanılan objektif lensin namlusunun kabul edecek kadar büyük olduğundan emin olarak merkeze 50 mililitrelik bir konik tüp yerleştirin.
Suda% 3 agarose yapın ve cam tabak ile konik tüp arasındaki boşluğa dökün, ardından bir saat soğumasını bekleyin. Bu katı agarose halkası oluşturacak. Dokuyu süper tutkal kullanarak odanın dibine güvenli bir şekilde yapıştırın ve odayı havadan korunmadığı ve dört santigrat derecede depolanmadığı sürece polimerize olmaya başlayabilecek kırılma indeksi eşleştirme çözeltisi ile doldurun.
Konfokal mikroskop kullanarak görüntüyü alın. İlgili tüm görüntüleme ekipmanlarını açın. Örneği sahne alanına yerleştirin.
Daldırma ortamına hedefle dikkatlice yaklaşın ve sürekli bir medya sütunu oluşturur. Epifluoresansı kullanarak uygun bir görüntüleme alanı bulun. Çözünürlük ve tarama hızı ayarlarını ayarlayarak başlayın.
Konfokal mikroskop kullanarak görüntüleme yapıyorsanız, en küçük optik bölümü ve dolayısıyla en iyi Z çözünürlüğünü elde etmek için iğne deliğini tamamen kapatın. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip uygun bir görüntü elde edilene kadar lazer gücünü veya sensör kazancını kademeli olarak artırın. Standart EGFP veya tdTomato iki renkli görüntüleme kullanıyorsanız, ışık toplama ayarlarını yapın.
Z-stack parametrelerini dokunun gözlemlenen başlangıç ve bitiş noktalarına göre ayarlayın. Adım boyutunu istediğiniz Z çözünürlüğe göre ayarlayın. Daha küçük adım boyutları daha fazla Z çözünürlüğü sağlar, ancak örnek ağartmaya neden olabilir.
Görüntü alma ayarlarından memnun olduğunuzda, görüntüyü alın. Görüntünün yüksek sinyal-gürültü oranına sahip olduğundan ve yapıların farklı sınırlarını gösterdiğinden emin olun. Görüntü alındıktan sonra, temsili hücre morfolojisi gömülü istatistikler kullanılarak ve analiz yazılımı içindeki komut dosyalarını sınıflandırarak analiz edildi.
Toplanan veriler, Neuron 2'nin Nöron 1'e kıyasla daha yüksek omurga yoğunluğuna sahip dendritik yapıdan daha büyük olduğunu yansıtmaktadır. Bu sonucu doğrulamak için, Neuron 2'nin, somadan 50 ila 100 mikrometredeki Scholl kavşaklarının sayısının artmasıyla belirtildiği gibi Nöron 1'den daha dendirik olarak daha karmaşık olduğunu doğrulayan standart Scholl analizi yapıldı. Nöron 1, daha filopodia benzeri şekillere sahip daha büyük bir omurga oranı içerir ve olgunlaşmamış bir omurga alt tipidir.
Mantar dikeni olarak adlandırılan tanımlanmış kafalara sahip dikenler muhtemelen daha gelişmiş ve olgun sinapslar içerir. Böylece, Neuron 2 daha olgun dikenlerin daha yüksek yoğunluğu ile daha olgundur. Temizlendikten sonra, doku parçaları geleneksel immünhistokimya kullanılarak boyanabilir.
