大规模多组学全基因组关联研究 （Mo-GWAS）：样品制备和归一化指南

研究更大的人口伴随着机器驱动的变异，由此产生的实际变异源于自然多样性。在这里，我们演示一种减少下游集成分析的技术变化的方法。该技术的优点包括基于面部分离的提取，在各自的分析平台上提供各种代谢物的分析，同时消除系统误差并保持生物学差异。

一旦获得基因型和表型信息，该方法可以应用于任何生命王国中的任何不同自然种群。要开始使用20毫升的收获管，加入两个五毫米和两个直径为8毫米的金属珠进行均质化并标记管。然后，用液氮填充杜瓦瓶，在通过快速冷冻在液氮中切割收获新鲜叶子和根组织样品后立即。

将收获的生物样品储存在80摄氏度下以进行进一步处理。在液氮中预冷管架。接下来，将组织以25赫兹研磨一分钟以获得均匀的粉末。

重复冷冻，如果组织没有均匀研磨，则进行研磨。在预先冷却的标记的两毫米安全锁微量离心管中称量50毫克新鲜植物材料，确保植物材料在称重过程中保持冷冻状态。加入1毫升预冷的提取混合物1至50毫克等分试样的样品，并在保持冰上之前短暂涡旋管。

将样品在轨道振荡器上以800倍G在4摄氏度下孵育10分钟，然后在冰冷的超声浴中超声处理10分钟。使用多通道移液管将500微升的提取混合物也加入到样品中，并通过短暂的涡旋混合提取物，然后在4摄氏度下以11， 200倍G离心混合物5分钟。离心后，将分离的500微升上含脂相转移到预先标记的1.5毫升安全锁微量离心管中，除去其余上相。

在单独的1.5毫升安全锁式微量离心管中转移150微升的低半极相四个GCMS和300微升的半极相四个U-H-P-L-C MS分析。使用真空浓缩器进行溶剂蒸发，在不加热的情况下浓缩所有提取的馏分，并将干燥的馏分储存在20摄氏度。为了制备超高性能样品，液相色谱，质谱或H-P-L-C MS将干燥的半极性级分重新悬浮在180微升甲醇和水的混合物中。

然后将半极相超声处理2分钟，然后在11，200倍G下离心一分钟。离心后，将90微升的上清液转移到玻璃小瓶中，并将两微升的提取物注入LCMS样品中倒入。在保持在40摄氏度的反向相C18柱上进行代谢物分馏，并且随着流出物A和B的逐渐变化，每分钟400微升的流量，以负电离模式获取测试空白和质量控制样品的质谱，质量范围为102 1500质量与电荷比。

对于半极性代谢物样品，在负电离和正电离模式下以数据依赖性串联质谱法运行合并的QC样品。使用获得的质谱进行注释。通过检查内部标准的分布来执行数据集的归一化。

通过校正单个或多个内部标准的信号来规范化数据。接下来，校正从色谱图获得的峰强度与确切样品重量的关系。为了校正多批次序列的强度漂移，请执行基于QC的校正方法，例如使用R进行局部估计散点图平滑，在执行全基因组关联研究或GWAS之前，使用流苏过滤小于5%的次要等位基因频率和超过10%的缺失率的基因型数据。

这将避免低频偏置。为了消除源自环境因素的偏差，请使用R包LME四，并计算实验重复中每个归一化特征的最佳线性，无偏预测或blops。使用每个特征的斑点单独使用RMVP包进行GWAS，根据来自不同批次的两个QC样品的原始碱基峰色谱图显示几种常见豆类物种的脂质组数据。

在某些脂质类别中观察到信号强度的变化。当对原始数据进行主成分分析时，系统误差更为明显。归一化过程（包括局部估计的散点图平滑）导致 QC 样品聚类。

当剖析到各个集群时，批次 7 和 8 中的机器驱动错误在归一化之前变得清晰，并得到纠正。将归一化和转化后的个体代谢组簇用于GWAS，产生几个性状标记关联。在代表性分析中，不同的化合物类别以不同的颜色突出显示，而与多个化合物类别相关的标记物以其最近的基因表示。

数据规范化和转换是最重要的步骤之一。确保已执行适当的校正以校正系统误差，并确保分布中的正态性。通过对分析变异进行校正，可以执行几种整合方法，例如代谢相关性分析和整合到表型组数据中以阐明复杂性状。