降解FFPE-RNA样品测序与分析优化

我们的协议可用于提高从FFPE衍生的RNA样本生成的基因表达数据的质量和数量，特别是在质量欠佳的样品中。该技术评估FFPE组织样品中的RNA质量，并优化其下游处理，以提高样品测序数据的数量和质量。此方法允许在生物和临床样本中全面鉴定成绩单，并可能提供对基因组在发育和疾病中的功能元素的洞察。

FFPE-RNA降解和样品质量控制方法的选择、库制备和数据分析都十分棘手。在选择正确的方法和适当的控制措施时要一丝不苟。视觉演示允许观看者观察在规划、评估和测序过程中所需的细微修改和预防措施，尤其是对于保存不善的 FFPE 样品。

要检查RNA样品的质量，请根据制造商的说明在RNA QC系统上运行样品，并使用适当的生物分析软件分析样品中RNA片段的分布，并计算超过100个和200个核苷酸的片段比例。根据质量控制指标，识别片段少于 40% 的样本，其片段时间超过 100 个核苷酸，以便排除这些样品的加工。对于测序，根据室温水浴中的运行参数解冻相应的测序试剂盒，并在解冻后将试剂盘放在四摄氏度。

将流量电池包装在室温下放置 30 分钟。当包正在变暖时，打开 Illumina 实验管理器应用程序并选择"创建示例表"。选择要使用的音序器，然后单击"下一步"。

输入试剂盒条形码和其他适当的工作流程参数。然后上传根据 Illumina 序列条件创建的示例表。要准备样本库和控制库 PhiX，请将数据库进行变性和稀释到适当的浓度，并混合样品和 PhiX 控制库以获得 5% PhiX 控制容积比。

当流动细胞准备就绪时，取出包装，用无绒醇擦拭清洁玻璃表面，然后用低绒实验室组织擦干玻璃。从四摄氏度的存储中取出试剂盒，并反转墨盒五次以混合试剂。轻轻敲击工作台上的墨盒，以减少气泡，将变性和稀释的样品装入指定储液罐中的试剂盒中。

将流动电池、缓冲盒和试剂盒加载到系统中。然后执行自动检查并检查输出，以确保运行参数通过系统检查。自动检查完成后，选择开始排序运行。

要可视化预处理 QC 和对齐后 QC 结果，请运行多 QC 以 HTML 格式生成聚合报告。若要确定批处理效果并评估给定数据集的质量映射，请使用 R 脚本运行主组件分析。然后，可以使用不同样本之间的 Pearson 相关性进行样本相关性分析。

估计超过100个核苷酸的片段比例比估计超过200个核苷酸的片段更有用，因为它对于准确测量高降解RNA样本较小片段比例更敏感。鉴于样品组的高降解程度，建议采用总RNA库制备方法。例如，此处显示了从四个不同的样本编写的排序库。

此处显示了原始 FastQ 文件排序质量和示例适配器内容的概述。FastQC 筛查有助于检测样品中的细菌或小鼠污染等污染。STAR 对齐可用于确定映射到参考基因组的读取比例、唯一映射到参考基因组的读取百分比以及未映射或映射到多个位置的读取比例。

卡和 RSeQC 统计信息可用于确定映射读取中信使 RNA、电子基和互生基的百分比。对于这些具有代表性的分析，一些降级的库存在三个主要偏差，其中，与五个主要端更靠近三个黄金末尾的读取映射更多。此外，还可以执行主要成分分析，以确定每个样品的生物复制的主要成分捕获的总变异百分比。

注意避免样品降解，为每个样品准备复制和多个涂层，使用适当的指标来评估样品质量，并使用正确的库准备方法。使用这种方法，可以使用以前无法使用的 FFPE 样本进行更大的 NGS 研究，这些样本具有不同的存储时间和条件，从而深入了解各种不同的疾病状态。该技术为研究人员研究现有的具有丰富临床信息的大型FFPE样本档案铺平了道路，可以大大加强基于人群的癌症研究。