此协议可用于对共生细菌进行基因操作，在这种情况下，特别是在伯克霍尔德里亚，并识别对昆虫宿主进行殖民所必需的基因。跨波森插入测序是一个强大的工具，用于在单个实验中同时识别大量有条件的基本基因。首先，在10毫升LB介质中接种大肠杆菌捐赠者的新捐赠者培养物，并在无菌罩下补充卡纳霉素和DAB。
接种伯克霍尔德里亚角膜菌株五毫升KB介质的受体细胞。在 250 RPM 的摇床上在 30 摄氏度的夜间孵育文化。隔夜生长后，离心机以9，600倍G的速度将每个培养物的4毫升离心器压入细胞并丢弃超高分子。
在无菌罩下，在含有 DAP 的 KB 介质中清洗颗粒细胞培养物。最后，将文化分别重新用四毫升的 KB 加 DAP 介质进行重新使用。在新鲜的15毫升管中，将250微升被洗大肠杆菌供体细胞与一毫升被洗过的伯克霍尔德里亚角蛋白菌株A受体细胞混合。
在含有 DAP 的 KB 琼脂板上发现这种结合细胞混合物的 10 微升。让盘子在室温下在无菌罩中不受干扰地休息一小时。将板块与结合点在30摄氏度下孵育12至18小时。
孵化后，在无菌罩下的板上加入两到四毫升的1X PBS，然后使用细胞刮刀从琼脂中释放生长的细菌结合点。然后将结合的细胞混合成两毫升微搅拌管。通过离心将细胞以9，600倍G为2分钟。
丢弃超高纳特，通过上下管道在 1X PBS 的一毫升中清洗颗粒两次。在 1X PBS 的 1，200 微升中重新使用最终颗粒。混合好，将100微升细胞混合物撒在大型KB阿加板上，辅以卡纳霉素，并在30摄氏度的夜间孵育。
计算三个板块上的跨相聚落总数，并推断以计算所有板块中获得的突变体的大致数量。为了增加获得代表性库的机会，确保菌落总数比基因组中的基因总数高几倍。为了确认结合的成功，使用手稿中描述的 10 到 20 个样本菌落对插入盒进行 PCR 定位。
在无菌罩下，通过在油上添加一到两毫升1X PBS，将菌落从盘子中刮掉。将从板中刮掉的细胞混合物池到 50 毫升管中。漩涡库要彻底混合，然后将一毫升的聚合突变库分成几个冷冻管。
在管子中加入一毫升70%甘油，储存在零下80摄氏度。选择 L.villosa 鸡蛋离合器，并计算如果离合器包含超过 100 个鸡蛋，则继续计算鸡蛋数量。要对整个鸡蛋离合器进行消毒，加入 200 微升 70%乙醇，轻轻清洗鸡蛋 5 分钟，然后取出乙醇，用自洗水洗蛋两次。
加入200微升12%漂白剂，轻轻清洗鸡蛋30秒。立即取出漂白剂，用200微升自动洗净水再次清洗鸡蛋三次。使用 PBS 中洗过的突变库的每个微升的 2 倍 10 到 6 个细胞感染灭菌鸡蛋离合器中的卵子。
受感染的甲虫幼虫孵化两天后，每1.5毫升微灌注管收集100秒星形幼虫，储存在零下80摄氏度。为了生成体外控制库，在含有卡纳霉素的 KB 介质的 10 毫升 KB 介质中，为突变库的每个微升接种 250 个 2 倍 10 到 6 个细胞的微升。从体内和体外生长的突变库提取DNA后，与超声波仪共享DNA。
为了检查DNA是否被剪切到所需的尺寸范围，在与凝胶加载染料以1比1的比例混合后，在250伏特的1.6%的玫瑰凝胶运行40分钟后，装载5微升未剪切和剪切的DNA。要准备适配器结结所需的片段末端，首先在剪切的DNA的50微升中加入3个酶混合物的微升和7个微升的反应缓冲器，然后通过管道混合好。将加热盖的热循环器设置在大于或等于 75 摄氏度时，在 20 摄氏度下孵育样品 30 分钟，在 65 摄氏度下孵育 30 分钟，然后将温度保持在 4 摄氏度。
对于适配器结结，在端准备步骤的产品中加入30微升的结结主组合、1微升的结结增强剂和2.5微升的稀释适配器。通过管道彻底混合，在温度循环器中加热盖子，在20摄氏度下孵育样品15分钟。15分钟后，加入3微升酶。
通过管道混合，在37摄氏度的热循环器中孵育样品15分钟，盖子加热温度大于或等于47摄氏度。要选择适配器的配对DNA大小，针对250个碱基对的片段，首先通过涡旋磁珠溶液，并在室温下放置30分钟，然后再使用。将 0.3 倍的珠子加入 96.5 微升的液化 DNA 混合物中，通过透彻的管道混合。
孵化珠子混合物五分钟。将管子放在磁架上，拉下珠子，去除不需要大小的DNA片段。让珠子沉淀五分钟，然后将透明超高超人转移到一个新的微灌管。
将0.15倍的新鲜珠子加入超高音，通过管道进行混合。将珠子混合物孵育五分钟，然后将管子放在磁架上，以拉下与目标DNA相连的珠子。等待五分钟，然后丢弃超高那，保留珠子。
在磁架上放上珠子时，加入200微升新制备的80%乙醇，等待30秒后再丢弃乙醇，而不会打扰珠子。从支架上取下管子，加入 17 微升 0.1X TE 或低 TE，然后通过管道混合 10 次，并在室温下孵育混合物两分钟。将管子放在磁架上，取15微升大小选择的DNA用于PCR-1。
漩涡链球，并把它们放在室温下至少30分钟。取32微升的珠子，用500微升的1X束缚和洗涤缓冲。加入32微升的2X束缚和洗涤缓冲和重新悬浮珠。
为此，添加 32 微升的清理 PCR-1 产品。在室温下彻底混合并孵育30分钟。将珠子DNA混合物放在磁架上两分钟。
派佩特把超高纳特作为生物素标记的DNA， 含有插入边缘与珠子上的链球菌素结合。用 500 微升 1X 束缚和洗缓冲器清洗珠子，然后用 200 微升低 TE 洗珠子。将DNA束缚珠子重新沉浸在低TE的17微升中。在超声波仪中提取和碎片的体内和体外生长突变库的DNA显示，大部分片段跨越100至400个碱基对。在豆瓣中可以观察到伯克霍尔德里亚角卵石菌株A基因组的四个复制物的转波介导插入的位置。
表中可以观察到测序输出的摘要以及三个体外和体外库中命中的独特插入和基因数量。要记住的要记住的一点是计算宿主殖民化期间的人口瓶颈大小，以便在感染期间获得适当的库表示。此外，在体外和宿主中调整相容的细菌代数。
生成转位子突变库后，可在选择性介质上进行筛选，以基于表型差异恢复突变体。因此，可以识别对一个条件很重要的特定基因。
