生物发光光遗传学2.0:利用生物发光在体外和体内激活光敏蛋白

1（电子色调）生物发光光遗传学是一种平台技术，其中遗传编码的光源可以可视化和控制细胞内和细胞之间的生物功能和网络。生物发光到达目标细胞群中表达的每个光传感域，而不会受到光纤和延长物理光照射的任何组织和细胞损伤。首先，通过将5毫克冻干CTZ溶解在250微升的相应溶剂中来开始制备荧光素储备。

通过移液确保沿壁的CTZ溶解。在保护小瓶免受直射光的同时，在0.5毫升黑色微量离心管中制备50微升等分试样，并将等分试样储存在零下80摄氏度以备将来使用。在由红灯照亮的层流罩中，在光线紧凑的房间里执行所有进一步的操作。

为了进行单次生物发光光刺激，在细胞培养基中制备荧光素的工作溶液，然后以100微摩尔的终浓度加入细胞。将含有荧光素的培养基加入细胞中，并孵育所需的光刺激持续时间。关掉红灯。

等待几秒钟，直到眼睛完全变黑，然后监测眼睛的光发射。通过拍照记录光发射。通过用培养基替换含有荧光素的培养基来终止光刺激，然后用培养基洗涤细胞一次或两次，以根据实验灵敏度消除所有荧光素。

为避免细胞损失，将细胞接种在PDL包被的培养皿上并孵育细胞。为了进行重复的生物发光光刺激，通过使用盒子和黑色片在活细胞成像显微镜周围创建一个光密隔室来设置活细胞成像室。确保覆盖房间内存在的所有光源。

使用所需的进气溶液和导致废物容器的腔室输出设置灌注系统。根据重复刺激的次数，将制备的工作荧光素成像溶液等分到微量离心管中。将装有转染细胞的盖玻片放在腔室中。

在保持泵运行的同时，从进气杯中取出泵的进气管。快速将入口管浸入荧光素溶液中，保持较短的过渡时间，以避免管子中的任何空气空隙。一旦荧光素溶液被吸收，将入口管放回进气杯中。

根据需要多次重复取出并将入口管浸入荧光素中，间隔几分钟至数小时，具体取决于细胞应该暴露的生理模式。然后将细胞保持在光保护环境中16至24小时进行转录或持续时间，直到评估光刺激的效果。为了在体内进行生物发光激活，通过从零下80摄氏度取出CTZ小瓶来制备荧光素，然后在光保护区域将其加热至室温。

对于每个含有500微克CTZ的小瓶，使用移液管加入250微升无菌水，然后将橡胶塞放回小瓶上。将重构的玻璃小瓶在55摄氏度的水浴中孵育几分钟，以完全溶解粉末。将溶液转移到黑色微量离心管中，并冲洗墙壁以取回所有CTZ。

除去所需溶液量后，将剩余的溶液储存在四摄氏度。在以类似方式制备、重构和等分载体之后，通过除去所需的体积的荧光素或载体的大小和所选择的应用路线来预制生物发光光刺激。按照设计向动物注射荧光素或车辆。

对于特定行为范式期间所需的重组酶激活，请在行为测试之前注射动物。对于相位转录，在几天内反复注射动物，并按照设计从生物发光刺激的动物中收集数据。快速光和活性调节表达系统允许转录具有增加的细胞内钙离子和光的报告基因。

蓝色LED导致强大的报告荧光，并且在添加荧光素后通过发光测量确定FLuc表达。在体内成像系统中，LED和CTZ都稳健地增加了FLuc表达，而转录因子成分的存在单独导致相当大的背景信号，可能是由于自发蛋白水解。NanoLuc通过CRY / CIB二聚化和光敏转录因子EL222用于光原调节。

对于CRY/CIB和EL222，向HEK-293细胞添加hCTZ并在15分钟后将其去除所诱导的生物发光比LED曝光20分钟更有效。当与hCTZ共转染时，两个系统之间的转录功效没有显着差异，尽管CRY / CIB的融合蛋白比EL222更有效。与EL222相比，CRY / CIB显示出与hCTZ浓度无关的更高背景水平。

测试了基于VVD LOV蛋白iCreV的光敏分裂Cre重组酶的生物发光。CTZ应用的结果表明，CTZ的存在在背景上稳健地增加了表达，并且类似于LED应用。使用生物发光不仅激活铁移动的光感受器，而且激活任何光感受域都为光刺激增加了另一个维度，扩展了跨时间和空间尺度的细胞功能的操纵。

生物发光光遗传学已应用于细胞和模式生物。这些方案可以定制，以在体外和体内测试广泛的定向假设。