Биолюминесцентная оптогенетика представляет собой платформенную технологию, в которой генетически закодированные источники света могут визуализировать и контролировать биологические функции и сети внутри и между клетками. Биолюминесценция достигает каждого светочувствительного домена, экспрессируемого в популяции клеток-мишеней, без какого-либо повреждения тканей и клеток волоконной оптикой и длительным физическим воздействием света. Для начала начните подготовку запаса люциферина, растворив пять миллиграммов лиофилизированного CTZ в 250 микролитрах соответствующего растворителя.
Обеспечьте растворение CTZ вдоль стен путем пипетки. Защищая флакон от прямого света, подготовьте 50 микролитровых аликвот в 0,5-миллилитровых черных микроцентрифужных трубках и храните аликвоты при минус 80 градусах Цельсия для будущего использования. Выполняйте все дальнейшие манипуляции в светлом тесном помещении в ламинарной вытяжке, освещенной красным светом.
Для выполнения одиночной биолюминесцентной световой стимуляции готовят рабочий раствор Люциферина в клеточной культуральной среде, незадолго до добавления в клетки в конечной концентрации 100 микромоляров. Добавьте в клетки среду, содержащую люциферин, и инкубируйте в течение желаемой продолжительности световой стимуляции. Выключите красный индикатор.
Подождав несколько секунд, пока глаза не приспособятся к полной темноте, следите за излучением света на глаз. Задокументируйте излучение света, сделав фотографию. Прекратите световую стимуляцию, заменив питательную среду, содержащую люциферин, затем промыть клетки культуральной средой один или два раза, чтобы устранить весь люциферин в зависимости от чувствительности эксперимента.
Чтобы избежать потери клеток, наносите клетки на чашки, покрытые PDL, и инкубируйте клетки. Чтобы выполнить повторную биолюминесцентную световую стимуляцию, настройте камеру визуализации живых клеток, создав легкий плотный отсек вокруг микроскопа визуализации живых клеток с помощью коробки и черных листов. Убедитесь, что все источники света присутствуют внутри комнаты.
Настройте перфузионную систему с желаемым раствором для впуска и выхода в камеру, ведущую к контейнеру для отходов. В зависимости от количества повторных стимуляций, аликвотируйте подготовленный рабочий раствор для визуализации Люциферина в микроцентрифужные трубки. Поместите в камеру крышку с трансфектированными клетками.
Поддерживая работу насоса, снимите впускную трубку насоса с впускного стакана. Быстро погружайте впускную трубку в раствор люциферина, сохраняя короткое время перехода, чтобы избежать пустоты воздуха в трубке. Как только раствор Люциферина будет принят, поместите впускную трубку обратно в всасывающий стакан.
Повторяйте удаление и погружение входной трубки в люциферин столько раз, сколько необходимо, с интервалом от нескольких минут до часов в зависимости от физиологического паттерна, которому должны подвергаться клетки. Затем храните клетки в защищенной от света среде в течение 16-24 часов для транскрипции или продолжительности до тех пор, пока не будет оценен эффект световой стимуляции. Чтобы выполнить активацию биолюминесценции in vivo, приготовьте Люциферин, вынув флакон CTZ при минус 80 градусах Цельсия, а затем дайте ему нагреться до комнатной температуры в защищенной от света зоне.
К каждому флакону, содержащему 500 мкг КТЗ, добавьте 250 микролитров стерильной воды с помощью пипетки и положите резиновую пробку обратно на флакон. Инкубируйте восстановленный стеклянный флакон на водяной бане, закаленной при 55 градусах Цельсия, в течение нескольких минут, чтобы полностью растворить порошок. Переложите раствор в черную микроцентрифужную трубку и промойте стенки, чтобы извлечь весь CTZ.
После удаления необходимого количества раствора храните оставшийся раствор при четырех градусах Цельсия. После подготовки, восстановления и алицитирования транспортного средства аналогичным образом преформируйте биолюминесцентную световую стимуляцию путем удаления объема люциферина или транспортного средства, необходимого для размера животного и выбранного маршрута применения. Введите животному люциферин или транспортное средство, как задумано.
Для желаемой активации рекомбиназы во время определенной поведенческой парадигмы вводите животное непосредственно перед поведенческим тестированием. Для фазовой транскрипции вводите животному несколько раз в течение нескольких дней и собирайте данные от животного, стимулируемого биолюминесценцией, как это было задумано. Система экспрессии быстрого света и активности, регулируемая экспрессией, позволила транскрибировать репортерный ген с увеличением внутриклеточных ионов кальция и света.
Синий светодиод привел к надежной репортерной флуоресценции, а экспрессия FLuc была определена измерениями люминесценции после добавления люциферина. В системе визуализации in vivo как светодиод, так и CTZ надежно увеличивали экспрессию FLuc, в то время как присутствие одного только компонента транскрипционного фактора приводило к значительному фоновому сигналу, возможно, из-за спонтанного протеолиза. NanoLuc использовался для оптогенной регуляции через димеризацию CRY/CIB и фоточувствительный транскрипционный фактор EL222.
Биолюминесценция, индуцированная добавлением hCTZ к клеткам HEK-293 и его удалением через 15 минут, была более эффективной, чем 20 минут воздействия светодиодов для CRY/CIB и EL222. Не наблюдалось существенных различий в эффективности транскрипции между двумя системами при совместном трансфектировании hCTZ, хотя слияния белков CRY/CIB были более эффективными, чем EL222. CRY/CIB показали стабильно более высокие фоновые уровни по сравнению с EL222 независимо от концентрации hCTZ.
Была протестирована биолюминесценция фоточувствительной расщепленной рекомбиназы Cre на основе белка VVD LOV iCreV. Результаты применения CTZ показали, что присутствие CTZ надежно увеличивает экспрессию на заднем плане и похоже на применение светодиодов. Использование биолюминесценции для активации не только движущихся фоторецепторов железа, но и любых фотосенсорных доменов добавляет еще одно измерение к световой стимуляции, расширяя манипулирование функциями клеток во временных и пространственных масштабах.
Биолюминесцентная оптогенетика была применена в клетках и модельных организмах. Эти протоколы могут быть настроены для проверки широкого спектра направленных гипотез in vitro и in vivo.
