1(גוונים אלקטרוניים)אופטוגנטיקה ביולומינסנטית היא טכנולוגיית פלטפורמה שבה מקורות אור מקודדים גנטית יכולים לדמיין ולשלוט בפונקציות ביולוגיות וברשתות בתוך התאים ובין התאים. ביולומינציה מגיעה לכל תחום חישת אור המתבטא באוכלוסיית תאי היעד ללא כל נזק לרקמות ולתאים על ידי סיבים אופטיים וחשיפה ממושכת לאור פיזי. כדי להתחיל, להתחיל להכין את מניית לוציפרין על ידי המסת חמישה מיליגרם של CTZ lyophilized ב 250 מיקרוליטרים של ממס בהתאמה.
להבטיח פירוק של CTZ לאורך הקירות על ידי צנרת. תוך הגנה על הבקבוקון מפני אור ישיר, להכין 50 aliquots microliter ב 0.5 מיליליטר צינורות מיקרו-צנטריפוגות שחורות ולאחסן את aliquots במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. בצע את כל המניפולציות הנוספות בחדר הדוק בהיר במכסה זרימה למינארי מואר באור אדום.
כדי לבצע גירוי אור bioluminescence יחיד, להכין פתרון עובד של לוציפרין במדיום תרבית התא, זמן קצר לפני הוספת לתאים בריכוז הסופי של 100 מיקרומולר. הוסף מדיום המכיל לוציפרין לתאים ודגר למשך הזמן הרצוי של גירוי אור. כבה את האור האדום.
לאחר המתנה של מספר שניות עד שהעיניים יסתגלו לחושך מוחלט, נטר את פליטת האור בעין. תעד את פליטת האור על ידי צילום תמונה. לסיים את גירוי האור על ידי החלפת המדיום המכיל לוציפרין במדיום התרבות, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם מדיום תרבית פעם או פעמיים כדי לחסל את כל לוציפרין בהתאם לרגישות הניסוי.
כדי למנוע אובדן תאים, צלחת התאים על כלים מצופים PDL ודגור התאים. כדי לבצע גירוי אור ביו-לומינציה חוזר ונשנה, הגדר את תא ההדמיה של התא החי על-ידי יצירת תא הדוק בהיר סביב מיקרוסקופ הדמיית התא החי באמצעות קופסה וסדינים שחורים. ודאו שכיסו את כל מקורות האור הקיימים בתוך החדר.
הגדר את מערכת הזלוף עם הפתרון הרצוי לצריכה ואת תפוקת התא המובילה למיכל פסולת. בהתאם למספר של גירויים חוזרים, aliquot את פתרון הדמיה לוציפרין עובד מוכן לתוך צינורות microcentrifuge. מניחים כיסוי עם תאים שהודבקו בתא.
תוך שמירה על המשאבה פועלת, להסיר את צינור הכניסה של המשאבה מכוס הצריכה. לטבול במהירות את צינור הכניסה בתמיסת לוציפרין, תוך שמירה על זמן המעבר קצר כדי למנוע כל חלל אוויר בצינורות. ברגע פתרון לוציפרין נלקח, למקם את צינור הכניסה בחזרה לתוך הצריכה.
חזור על הסרה וטבילה צינור הכניסה לוציפרין פעמים רבות ככל שנדרש במרווחים של כמה דקות עד שעות בהתאם לתבנית הפיזיולוגית שאליה התאים אמורים להיחשף. לאחר מכן לשמור על התאים בסביבה מוגנת אור במשך 16 עד 24 שעות עבור שעתוק או את משך הזמן עד ההשפעה של גירוי אור מוערך. כדי לבצע את הפעלת bioluminescence ב vivo, להכין לוציפרין על ידי לקיחת בקבוקון CTZ מתוך מינוס 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לתת לו להתחמם לטמפרטורת החדר באזור מוגן אור.
עבור כל בקבוקון המכיל 500 מיקרוגרם של CTZ, להוסיף 250 מיקרוליטרים של מים סטריליים באמצעות פיפטה ולשים את פקק הגומי בחזרה על הבקבוקון. לדגור בקבוקון זכוכית משוחזר באמבט מים מזג ב 55 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות כדי להמיס לחלוטין את האבקה. מעבירים את התמיסה לצינור מיקרוצנטריפוגה שחורה ושטפו את הקירות כדי לאחזר את כל ה- CTZ.
לאחר הסרת כמות הפתרון הדרושה, לאחסן את הפתרון הנותר בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הכנה, שחזור, ו aliquoting הרכב באופן דומה, preform את גירוי אור bioluminescence על ידי הסרת הנפח של לוציפרין או הרכב הדרוש לגודל של החיה ואת מסלול היישום שנבחר. הזרקו לחיה לוציפרין או רכב כמתוכנן.
להפעלה הרצויה של רקומבינאז במהלך פרדיגמה התנהגותית ספציפית, הזריקו את החיה ממש לפני הבדיקה ההתנהגותית. עבור שעתוק פאזי, להזריק את החיה שוב ושוב במשך ימים ולאסוף את הנתונים מן החיה מגורה bioluminescence כפי שתוכנן. אור מהיר ומערכת ביטוי מווסתת פעילות אפשרה שעתוק של הגן הכתב עם יוני סידן תאיים מוגברים ואור.
נורית LED כחולה הובילה פלואורסצנטיות עיתונאית חזקה וביטוי FLuc נקבע על ידי מדידות אור לאחר תוספת לוציפרין. במערכת הדמיה in vivo, הן LED והן CTZ הגדילו בחוזקה את הביטוי FLuc, בעוד נוכחותו של רכיב גורם שעתוק לבדה הביאה לאות רקע ניכר, אולי בשל פרוטאוליזה ספונטנית. NanoLuc הועסקה עבור רגולציה אופטוגנית באמצעות עמעום CRY / CIB גורם שעתוק רגיש EL222.
הביולומינציה הנגרמת על ידי תוספת של hCTZ לתאי HEK-293 והסרתה לאחר 15 דקות הייתה יעילה יותר מ -20 דקות של חשיפה LED עבור CRY / CIB ו- EL222. לא נצפו הבדלים משמעותיים ביעילות התמלול בין שתי המערכות כאשר הן נגועות בשיתוף עם hCTZ, אם כי חלבוני ההיתוך של CRY/ CIB היו יעילים יותר מאשר EL222. CRY/CIB הראה באופן עקבי רמות רקע גבוהות יותר בהשוואה ל- EL222 ללא תלות בריכוז HCTZ.
בדיקת הביולומינציה של רקומבינאז מפוצל רגיש לאור המבוסס על חלבון VVD LOV iCreV נבדקה. התוצאות של יישום CTZ גילו כי נוכחות CTZ הגדילה בחוזקה את הביטוי על הרקע והוא דומה ליישום LED. שימוש ביו-לומינציה כדי להפעיל לא רק קולטני אור הנעים מברזל, אלא כל תחומים פוטו-חושיים מוסיף ממד נוסף לגירוי אור המרחיב את המניפולציה של פונקציות התא על פני קשקשים זמניים ומרחביים.
אופטוגנטיקה ביולומינסנטית הוחלה בתאים ובאורגניזמים מודל. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים אישית כדי לבדוק מגוון רחב של השערות מכוונות במבחנה ו in vivo.
