1 (tons eletrônicos)A bioluminescente optogenética é uma tecnologia de plataforma na qual fontes de luz geneticamente codificadas podem visualizar e controlar funções biológicas e redes dentro e entre células. A bioluminescência atinge todos os domínios de sensoriamento de luz expressos na população celular-alvo sem qualquer dano tecidual e celular por fibra óptica e exposição prolongada à luz física. Para começar, comece a preparar o estoque de Luciferina dissolvendo cinco miligramas de CTZ liofilizado em 250 microliters de seu respectivo solvente.
Certifique-se de dissolução de CTZ ao longo das paredes por pipetação. Enquanto protege o frasco da luz direta, prepare 50 alíquotas de microliter em tubos de microcentrifusagem preto de 0,5 mililitro e armazene as alíquotas a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Realize todas as outras manipulações em uma sala apertada em um capô de fluxo laminar iluminado pela luz vermelha.
Para realizar uma estimulação de luz de bioluminescência única, prepare uma solução de trabalho da Luciferina em um meio de cultura celular, pouco antes de adicionar às células em uma concentração final de 100 micromolar. Adicione o meio contendo luciferina às células e incubar para a duração desejada da estimulação da luz. Desligue a luz vermelha.
Depois de esperar alguns segundos até que os olhos se ajustem para completar a escuridão, monitore a emissão de luz olho a olho. Documente a emissão de luz tirando uma foto. Termine a estimulação da luz substituindo o meio contendo luciferina pelo meio de cultura, depois lave as células com o meio de cultura uma ou duas vezes para eliminar toda a Luciferina, dependendo da sensibilidade do experimento.
Para evitar a perda de células, coloque as células em pratos revestidos de PDL e incuba as células. Para realizar repetidas estimulações de luz de bioluminescência, configure a câmara de imagem celular viva criando um compartimento leve e apertado ao redor do microscópio de imagem celular ao vivo usando uma caixa e folhas pretas. Certifique-se de cobrir todas as fontes de luz presentes dentro da sala.
Configure o sistema de perfusão com a solução desejada para a entrada e a saída da câmara levando a um recipiente de resíduos. Dependendo do número de estimulações repetidas, aliquot a solução de imagem lúciferina preparada nos tubos de microcentrifuge. Coloque uma mancha de cobertura com células transfeinadas na câmara.
Enquanto a bomba estiver funcionando, remova o tubo de entrada da bomba do béquer de entrada. Imerque rapidamente o tubo de entrada na solução de Luciferina, mantendo o tempo de transição curto para evitar qualquer vazio de ar na tubulação. Assim que a solução de Luciferina for retomada, coloque o tubo de entrada de volta no béquer de entrada.
Repita a remoção e imersão do tubo de entrada em Luciferina quantas vezes for necessário nos intervalos de vários minutos a horas, dependendo do padrão fisiológico ao qual as células devem ser expostas. Em seguida, mantenha as células em um ambiente protegido pela luz por 16 a 24 horas para transcrição ou duração até que o efeito da estimulação da luz seja avaliado. Para realizar a ativação da bioluminescência in vivo, prepare a Luciferin tirando um frasco de CTZ a menos 80 graus Celsius, depois deixe-o aquecido à temperatura ambiente na área protegida pela luz.
Para cada frasco contendo 500 microgramas de CTZ, adicione 250 microliters de água estéril usando uma pipeta e coloque a rolha de borracha de volta no frasco. Incubar o frasco de vidro reconstituído em um banho de água temperado a 55 graus Celsius por alguns minutos para dissolver completamente o pó. Transfira a solução para um tubo de microcentrifuuagem preto e enxágue as paredes para recuperar todo o CTZ.
Depois de remover a quantidade de solução necessária, armazene a solução restante a quatro graus Celsius. Após a preparação, reconstituição e aliquotação do veículo de forma semelhante, preforme a estimulação da luz de bioluminescência removendo o volume de Luciferina ou veículo necessário para o tamanho do animal e rota de aplicação escolhida. Injete o animal com Lúciferina ou veículo conforme projetado.
Para a ativação recombina desejada durante um paradigma comportamental específico, injete o animal pouco antes do teste comportamental. Para transcrição afásica, injete o animal repetidamente ao longo dos dias e colete os dados da bioluminescência estimulada animal conforme projetado. O sistema de expressão regulado por luz rápida e atividade permitiu a transcrição do gene repórter com íons de cálcio intracelulares aumentados e luz.
O LED azul levou a uma forte fluorescência de repórteres e a expressão FLuc foi determinada por medidas de luminescência após a adição de Luciferina. Em um sistema de imagem in vivo, tanto led quanto CTZ aumentaram robustamente a expressão FLuc, enquanto a presença do componente fator de transcrição sozinho resultou em um sinal de fundo considerável, possivelmente devido à proteólise espontânea. A NanoLuc foi empregada para regulação optogênica através do fator de dimerização cry/CIB e transcrição fotossensível EL222.
A bioluminescência induzida pela adição de hCTZ às células HEK-293 e sua remoção após 15 minutos foi mais eficiente do que 20 minutos de exposição led para CRY/CIB e EL222. Não foram observadas diferenças significativas na eficácia da transcrição entre os dois sistemas quando co-transfeinadas com hCTZ, embora as proteínas de fusão de CRY/CIB fossem mais eficientes que el222. O CRY/CIB apresentou níveis de fundo consistentemente mais elevados em comparação com o EL222 independente da concentração de hCTZ.
A bioluminescência de uma recombinase de cre dividido fotoensiva baseada na proteína VVD LOV iCreV foi testada. Os resultados do aplicativo CTZ revelaram que a presença de CTZ aumentou robustamente a expressão em segundo plano e é semelhante à aplicação LED. O uso da bioluminescência para ativar não apenas fotorreceptores móveis de ferro, mas qualquer domínio fotosensor adiciona outra dimensão à estimulação da luz expandindo a manipulação das funções celulares através de escalas temporais e espaciais.
A optogenética bioluminescente tem sido aplicada em células e organismos modelo. Esses protocolos podem ser personalizados para testar uma ampla gama de hipóteses direcionadas in vitro e in vivo.
