从新生小鼠中磁分离小胶质细胞用于原代细胞培养

该协议使我们能够在与体内特征非常相似的条件下培养小胶质细胞。使用磁性细胞分选技术，我们的方案允许我们在体外仅两天刺激小胶质细胞，而无需在培养基中使用任何血清。首先，用小剪刀从颈部到鼻子剪开皮肤，沿着 15 到 20 毫米的矢状缝合线。

插入尖端，大孔与颅骨平行。从两侧切到眼睛。用小剪刀剪开眼睛之间，将头骨和大脑与头部分离。

用两个镊子抓住靠近嗅球的头骨，然后小心地撕裂头骨。用剃须刀片去除小脑和嗅觉球，将大脑切成两块。将脑碎片放入含有40毫升不含钙和镁的HBSS的培养皿中。

根据此表制备解离混合物。将 12 个脑碎片转移到 C 管中，每个解离管的总重量为 1.2 克。然后将C管放在解离器上加热。

在解离器中启动优化的NTDK程序。离心20秒。通过移液三次完成机械解离。

将细胞转移到四个带有过滤器的15毫升管中。用10毫升含有钙和镁的HBSS冲洗过滤器。离心10分钟，用10毫升移液管除去上清液。

小心地加入10毫升含有钙和镁的HBSS，然后重新悬浮沉淀。再次，离心并除去上清液。用六毫升分选缓冲液重新悬浮沉淀。

重复离心并弃去上清液。然后加入 200 微升 CD11b 微珠溶液，并将试管在 4 摄氏度下孵育 15 至 20 分钟。孵育后，用六毫升分选缓冲液重新悬浮沉淀。

重复离心并用八毫升分选缓冲液重新悬浮沉淀。接下来，按照分离器上的波塞尔程序准备八列。通过一次添加一毫升细胞悬液使细胞通过色谱柱。

用一毫升分选缓冲液，在无菌洗脱板上洗脱CD11b阳性细胞。将细胞汇集在50毫升管中。离心并用10毫升冷小胶质细胞培养基重新悬浮沉淀。

计数CD11b阳性细胞。将细胞重新悬浮在冷小胶质细胞培养基中，以获得每毫升650，000至700，000个细胞的最终浓度。将悬浮液分配到细胞培养板中。

将板在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育过夜。第二天，用预热的小胶质细胞培养基替换培养基，并重复孵育过夜。在此步骤之前刺激细胞，并在刺激的最后三个小时内进行吞噬测定。

根据此表以每个细胞50个珠子的比例计算磁珠数量。准备珠子混合物。将试管在 37 摄氏度的水浴中孵育一小时。

每10分钟涡旋一次。向每个孔中加入计算出的珠状溶液体积并孵育三小时。使用这种方法，在通过促炎因子（例如白细胞介素-1 β）加干扰素 γ 或脂多糖刺激后评估小胶质细胞的吞噬活性。

刺激6至24小时后，用共聚焦显微镜分析荧光Cy3小胶质细胞珠。6小时后，小胶质细胞仅在白细胞介素-1 β加干扰素γ条件下开始吞噬Cy3磁珠。24小时后，两种刺激的Cy3荧光都有所增加，突出了吞噬活性的增加。

流式细胞术提高了小胶质细胞培养物的纯度，分选后细胞活力增加。使用流式细胞术和RT-qPCR细胞群标记物分析出生后第八天从小鼠大脑中分选CD11b阳性细胞之前和之后。这些分析区分了各种脑细胞群，例如用于小胶质细胞的CX3CR135，用于少突胶质细胞的O4或OLIG2，用于神经元的NeuN或突触素，以及用于星形胶质细胞的ACSA-2或GFAP。

使用CD11b抗体进行细胞分选后，仅获得小胶质细胞。重要的是在将悬浮液添加到色谱柱时非常轻柔地移液，以防止堵塞并避免机械细胞死亡。在这种方法之后，可以进行转录组蛋白质组学，例如蛋白质血液或Luminex，甚至免疫化学，以查看小胶质细胞刺激的效果。