Der mitochondriale Stoffwechsel ist ein wesentlicher Regulator der Haltbarkeit und des Gedächtnisses von T-Zellen. Die Messung der mitochondrialen Atmung liefert daher wichtige Einblicke in die Eigenschaften von T-Zellen. Die Seahorse-Maschine kann verschiedene Elemente der mitochondrialen Atmung in Echtzeit in lebenden menschlichen primären T-Lymphozyten messen, ohne dass eine Markierung erforderlich ist.
Diese Methode eignet sich sehr gut zur Überwachung der T-Zell-Fitness und des Gedächtnispotenzials, die wichtige Prädiktoren für den Erfolg der Krebsimmuntherapie sind. Waschen Sie zunächst CD3 / CD28-Perlen, indem Sie 12,5 Mikroliter Perlen pro Million Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und 12,5 Mikroliter PBS pro 12,5 Mikroliter der Perlen in der Tube hinzufügen. Legen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen für eine Minute auf einen geeigneten Magneten, entsorgen Sie den Puffer und suspendieren Sie die Perlen im ursprünglichen Volumen des T-Zell-Mediums.
Als nächstes fügen Sie 12,5 Mikroliter Perlen pro Million Zellen in einem Verhältnis von eins zu zwei Perlen zu Zellen hinzu und teilen Sie die Zellen in zwei Bedingungen mit jeweils etwa fünf Millionen Zellen auf. Fügen Sie dann jedem Zustand das richtige Volumen an Zytokinen hinzu und übertragen Sie die Zellen auf Multi-Well-Platten. Inkubieren Sie die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Nach drei Tagen Inkubation frisches T-Zell-Medium mit doppelter Zytokinkonzentration herstellen. Suspendieren und teilen Sie die Zellen auf, indem Sie die Hälfte des Volumens von jedem Bohrloch in ein neues Bohrloch übertragen. Fügen Sie dann das gleiche Volumen an frisch zubereitetem T-Zell-Medium zu jeder Vertiefung hinzu.
Für den extrazellulären Flussmittelassay ist eine Beschichtungslösung herzustellen, die Natriumbicarbonat, Cell-Tak und Natriumhydroxid enthält. Öffnen Sie dann eine frische XF-Zellkulturplatte und fügen Sie 12 Mikroliter der frisch zubereiteten Beschichtungslösung zu jeder Vertiefung hinzu, um eine gleichmäßige Verteilung der Beschichtungslösung am Boden aller Vertiefungen zu gewährleisten. Bebrüten Sie die Platte bei Raumtemperatur mit aufgesetztem Deckel für 30 Minuten.
Entsorgen Sie dann die verbleibende flüssige Lösung aus allen Vertiefungen. Waschen Sie die Platte mit 200 Mikrolitern sterilem Wasser und entsorgen Sie die Flüssigkeit. Als nächstes waschen Sie die Platte mit 200 Mikrolitern sterilem PBS in Zellkulturqualität.
Nachdem Sie die Flüssigkeit entsorgt haben, lassen Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Um T-Zellen in der XF-Zellkulturplatte zu platten, bereiten Sie 50 Milliliter Assay-Medien vor, indem Sie geeignete XF-RPMI-Medien mit Glukose, Pyruvat und Glutamin gemäß dem Versuchsaufbau mischen. Erhitzen Sie die vorbereiteten Medien in einem nicht kohlendioxidregulierten Inkubator auf 37 Grad Celsius und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
Stellen Sie sicher, dass genügend Medien zum Pflanzen von Zellen und zur Vorbereitung der Oligomycin- und FCCP-Lösungen vorhanden sind. Als nächstes entwerfen Sie ein Plattenlayout mit einer zunehmenden Anzahl von Zellen pro Vertiefung für die Optimierung oder den Assay-Lauf. Verwenden Sie vier Vertiefungen, die mit Medien gefüllt und mit Medien für Hintergrundmessungen injiziert werden.
Nachdem Sie die zuvor vorbereiteten T-Zellen gezählt haben, pipettieren Sie eine entsprechende Anzahl von Zellen zu jeder Vertiefung der zuvor beschichteten XF-Zellkulturplatte gemäß dem Plattenlayout. Um die T-Zellen auf der beschichteten Oberfläche zu verkleben, zentrifugieren Sie die XF-Zellkulturplatte. Waschen Sie dann die Zellen mit 200 Mikrolitern Assay-Medien.
Entsorgen Sie die Medien und fügen Sie 180 Mikroliter frische Assay-Medien hinzu. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Zellen befestigt und gleichmäßig über die Brunnenoberfläche verteilt sind, inkubieren Sie die XF-Zellkulturplatte bei 37 Grad Celsius im nicht kohlendioxidregulierten Heizraum für 30 Minuten. Bereiten Sie für den Optimierungslauf Arbeitslösungen von Oligomycin und FCCP in Assay-Medien vor.
Laden Sie dann die Arbeitslösungen von Oligomycin oder FCCP in die Einspritzanschlüsse der Sensorpatrone. Stellen Sie sicher, dass keine Einspritzöffnungen nur Luft enthalten. Füllen Sie alle leeren Ports mit Assay-Medien.
Entfernen Sie dann potenzielle Blasen in den Injektionsanschlüssen, indem Sie vorsichtig die Kanten der Platte auf dem Tisch klopfen. Bereiten Sie für den Assay-Durchlauf eine 20-Mikromol-Antimycin-A-Lösung vor. Laden Sie dann gemäß dem Plattenlayout 20 Mikroliter entweder Oligomycin oder FCCP in den Injektionsanschluss A der Sensorkassette und fügen Sie 22 Mikroliter Antimycin A zu Injektionsanschluss B aller Vertiefungen hinzu.
In einem repräsentativen Oligomycin-Optimierungslauf wird ein Plateau der Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR erreicht, wenn die akkumulative Konzentration ein Mikromol erreicht. Ab dieser Konzentration wurde die OCR nicht weiter reduziert. Für Zellen, die mit steigenden Konzentrationen des Entkopplers FCCP behandelt wurden, stiegen die OCR-Spiegel auf bis zu 0,2 Mikromolar FCCP und erreichten dann ein Plateau, was darauf hindeutet, dass eine vollständige Entkopplung erreicht wurde.
In einem repräsentativen Zellkonzentrationsoptimierungslauf beträgt die anfängliche OCR für einen Durchlauf mit 200.000 Zellen etwa die Hälfte davon mit 400.000 Zellen. Nach der FCCP-Behandlung beträgt die maximale OCR 61,6 Picomolen pro Minute für 200.000 Zellen und 190,4 Picomol pro Minute für 400.000 Zellen. Nach der Behandlung mit Oligomycin kollabiert die OCR im Durchlauf mit 200.000 Zellen in einen einstelligen Bereich und ist niedriger als im Durchlauf mit 400.000 Zellen.
Die Untersuchung der Wirkung der Zytokine Interleukin-2 und Interleukin-15 auf den Stoffwechsel von T-Zellen ergab, dass interleukin-15-kultivierte Zellen eine höhere maximale Atmung und freie Atemkapazität besaßen. Die Basalatmung und die ATP-Produktion waren jedoch nicht betroffen. Die Untersuchung des mitochondrialen Stoffwechsels in menschlichen T-Zellen liefert wichtige Hinweise auf ihre Haltbarkeit und ihr Überlebenspotenzial.
Dies führt zu einem erhöhten Wissen über die T-Zell-Fitness und kann letztendlich die Ansprechraten auf die Krebsimmuntherapie verbessern.
