חילוף החומרים המיטוכונדריאלי הוא רגולטור חיוני של עמידות וזיכרון תאי T. מדידת נשימה מיטוכונדריאלית ולכן נותן תובנות חשובות על המאפיינים של תאי T. מכונת סוסון הים יכולה למדוד אלמנטים שונים של נשימה מיטוכונדריאלית, בזמן אמת, בלימפוציטים T ראשוניים אנושיים חיים, ללא צורך בתיוג כלשהו.
שיטה זו מתאימה מאוד לניטור כושר תאי T ופוטנציאל הזיכרון, שהם מנבאים חשובים להצלחה אימונותרפית של סרטן. כדי להתחיל, לשטוף חרוזים CD3 / CD28 על ידי העברת 12.5 מיקרוליטרים של חרוזים למיליון תאים לצינור microcentrifuge והוספת 12.5 מיקרוליטרים של PBS לכל 12.5 מיקרוליטרים של החרוזים בצינור. לאחר מכן, מניחים את צינור המיקרוצנטריפוגה על מגנט מתאים למשך דקה אחת, משליכים את המאגר ומנצלים מחדש את החרוזים בנפח המקורי של מדיום תא T.
לאחר מכן, הוסיפו 12.5 מיקרוליטרים של חרוזים למיליון תאים ביחס של אחד עד שניים לתאים, וחלקו את התאים לשני תנאים עם כחמישה מיליון תאים בכל אחד מהם. לאחר מכן, הוסיפו את הנפח הנכון של ציטוקינים לכל תנאי, והעבירו את התאים ללוחות מרובי בארות. לדגור על התאים במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
לאחר שלושה ימים של דגירה, להכין בינוני תא T טרי עם ריכוז כפול של ציטוקינים. לחדש ולפצל את התאים על ידי העברת חצי נפח מכל באר לבאר חדשה. לאחר מכן, הוסף את אותו נפח של מדיום תא T מוכן טרי לכל באר.
לבדיקת השטף החוץ-תאי, הכינו פתרון ציפוי המכיל נתרן ביקרבונט, תא-טאק ונתרן הידרוקסיד. לאחר מכן, פתחו צלחת תרבית תאים XF טרייה, והוסיפו 12 מיקרוליטרים של פתרון הציפוי הטרי לכל באר, מה שמבטיח אפילו הפצה של פתרון הציפוי בתחתית כל הבארות. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר עם המכסה על במשך 30 דקות.
לאחר מכן, להשליך את התמיסה הנוזלית הנותרת מכל הבארות. לשטוף את הצלחת עם 200 microliters של מים סטריליים, ולהשליך את הנוזל. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת עם 200 microliters של PBS סטרילי כיתה תרבות התא.
לאחר השלכת הנוזל, אפשר לצלחת להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כדי צלחת תאי T בלוח תרבית התא XF, להכין 50 מיליליטר של מדיה לבדיקה על ידי ערבוב מדיה XF RPMI מתאים עם גלוקוז, פירובט, גלוטמין על פי ההתקנה הניסיונית. מחממים את המדיה המוכנה ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור מוסדר שאינו פחמן דו-חמצני, ומגדירים את רמת החומציות ל-7.4.
ודאו מספיק מדיה לנטיעת תאים ולהכנת פתרונות האוליגומיצין וה-FCCP. לאחר מכן, עצב פריסת לוח עם מספר גדל והולך של תאים לבאר עבור מיטוב או הפעלת בדיקה. השתמש בארבע בארות מלאות במדיה ומוזרקות עם מדיה למדידות רקע.
לאחר ספירת תאי T שהוכנו מוקדם יותר, פיפטה מספר תאים מתאים לכל באר של צלחת תרבית התא XF מצופה בעבר על פי פריסת הלוח. כדי לדבוק בתאי T למשטח המצופה, צנטריפוגה צלחת תרבית התא XF. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם 200 microliters של מדיה בדיקה.
השלך את המדיה והוסף 180 מיקרוליטרים של מדיה חדשה. לאחר שהבטיחו שהתאים מחוברים ומופצים באופן שווה על פני השטח של הבאר, דגרו את צלחת תרבית התאים XF ב-37 מעלות צלזיוס בארון החימום המוסדר שאינו פחמן דו-חמצני למשך 30 דקות. עבור הפעלת אופטימיזציה, להכין פתרונות עבודה של oligomycin ו FCCP במדיה assay.
לאחר מכן, לטעון את פתרונות העבודה של אוליגומיצין או FCCP לתוך יציאות ההזרקה של מחסנית החיישן. ודא כי אין יציאות הזרקה מכילות רק אוויר. מלא את כל היציאות הריקות במדיה של בדיקת מידע.
לאחר מכן, להסיר בועות פוטנציאליות ביציאות ההזרקה על ידי דפיקה בעדינות את הקצוות של הצלחת על השולחן. לריצת הבדיקה, להכין פתרון אנטימיצין 20 מיקרומולרי A. לאחר מכן, על פי פריסת הלוח, לטעון 20 microliters של או oligomycin או FCCP לתוך יציאת הזרקה A של מחסנית החיישן, ולהוסיף 22 microliters של אנטימיצין A להזרקת יציאה B של כל הבארות.
בריצה אופטימיזציה אוליגומיצין מייצג, רמה בשיעור צריכת חמצן, או OCR, הוא הגיע כאשר הריכוז המצטבר מגיע מיקרומולה אחת. מריכוז זה ואילך, זיהוי התווים האופטי (OCR) לא הצטמצם עוד יותר. עבור תאים שטופלו בריכוזים הולכים וגדלים של FCCP uncoupler, רמות OCR עלו עד 0.2 מיקרומולרי FCCP ולאחר מכן הגיעו לרמה, המציין כי ניתוק מלא הושג.
בריצת אופטימיזציה של ריכוז תאים מייצגת, זיהוי התווים האופטי (OCR) ההתחלתי לריצה עם 200,000 תאים הוא כמחצית מזה, עם 400,000 תאים. לאחר טיפול FCCP, OCR מקסימלי הוא 61.6 picomoles לדקה עבור 200, 000 תאים ו 190.4 picomoles לדקה עבור 400, 000 תאים. לאחר טיפול אוליגומיצין, OCR בריצה עם 200, 000 תאים מתמוטט לספרות בודדות והוא נמוך יותר מזה בריצה עם 400, 000 תאים.
חקירת ההשפעה של ציטוקינים interleukin-2 ו interleukin-15 על חילוף החומרים של תאי T גילה כי אינטרלוקין-15 תאים בתרבית היה בעל נשימה מקסימלית גבוהה יותר ויכולת נשימה חילוף. עם זאת, נשימה בסיסית וייצור ATP לא הושפעו. לימוד חילוף החומרים המיטוכונדריאלי בתאי T אנושיים נותן רמזים חשובים על עמידותם ופוטנציאל ההישרדות שלהם.
התוצאה היא ידע מוגבר של כושר תאי T ובסופו של דבר יכול לשפר את שיעורי התגובה האימונותרפית לסרטן.
