评估培养骨细胞和分离骨干中的氨基酸消耗

氨基酸的摄取和代谢对于成骨细胞的规格、分化和骨形成至关重要。该协议提供了一种快速而灵敏的方法来评估氨基酸摄取。我们的实验方案使用放射性标记的氨基酸来量化氨基酸的摄取。

这是一种廉价，灵敏且快速的方法，可以很容易地针对不同的条件进行修改。该协议可以很容易地修改以评估其他放射性标记的营养素（如葡萄糖和脂肪酸）在各种组织以及原代或转化细胞中的摄取。在补充有FBS，青霉素和链霉素的α MEM培养基中的12孔组织培养板的每个孔中开始氨基酸摄取测定板5倍10至第四个ST2细胞。

板额外的细胞孔以量化每个条件的细胞数以进行归一化。接下来，将细胞在 37 摄氏度的加湿细胞培养箱中用 5% 二氧化碳孵育两到三天，直到汇合。孵育后吸出培养基并用一毫升PBS在pH 7.4下洗涤细胞两次。

然后吸出PBS，然后用一毫升克雷布斯林格氏HEPES或KRH洗涤细胞一次。将细胞与0.5毫升新鲜制备的KRH一起孵育，每毫升L34氚化谷氨酰胺工作培养基含有四个微居里，孵育五分钟。孵育后，收集放射性介质以分配到液体废物容器中。

然后用冰冷的KRH洗涤细胞三次以终止反应。接下来，向每个孔中加入一毫升1%十二烷基硫酸钠，并将混合物研磨10次以裂解和匀浆细胞。然后将细胞裂解物转移到1.5毫升管中，并通过以10， 000G的最低速度离心10分钟来澄清裂解物。

将上清液转移到含有8毫升闪烁溶液的闪烁瓶中，并使用闪烁计数器读取每分钟的无线电活动和计数。从剩余的非放射性细胞板中，胰蛋白酶消化，重悬并计数细胞，以估计裂解的放射性培养物中的细胞数量。使用血细胞计数器，计算每个实验条件下每个非放射性孔的细胞数。

要确定氨基酸摄取，请在称量骨干之前从骨头中冲洗出骨髓。为了使骨骼去细胞化，请在 PBS 中以 100 摄氏度煮一个肱骨 10 分钟。在一毫升KRH中平衡活肱骨和煮沸的肱骨在37摄氏度的细胞培养箱中30分钟。

接下来，将实验和煮沸的对照骨分别在新鲜制备的KRH中孵育，每毫升L234三磷酸精氨酸含有四个微咖喱，在90摄氏度下在37摄氏度下孵育长达37分钟。去除放射性介质后，用一毫升冰冷的KRH洗涤肱骨三次终止反应。将每块骨头转移到装有 500 微升 RIPA 缓冲液的 1.5 毫升管中。

然后用剪刀切开100次，使肱骨和RIPA缓冲液均质化，然后以35%的振幅超声处理，脉冲10秒。通过在室温下以10， 000倍G离心10分钟澄清裂解物。离心后，将200微升上清液转移到含有8毫升闪烁溶液的闪烁瓶中。

使用闪烁计数器读取无线电活动。在存在或不存在甲基氨基异丁酸钠或锂的情况下，评估体外L34氚化谷氨酰胺摄取和汇合ST2细胞的动力学特性。钠的去除导致谷氨酰胺摄取减少90%。

与无钠条件相比，锂的存在使谷氨酰胺的摄取增加了2%。而甲基氨基异丁酸不影响谷氨酰胺的摄取。系统A，N，L或ASC和γ加L的估计百分比贡献表明，大多数谷氨酰胺摄取是由系统ASC介导的，γ加L.系统N负责大约2%的钠依赖性谷氨酰胺摄取。

系统A显示出0%的贡献和吸收。在两个小时的时间过程中分析了煮沸和活新生儿肱骨中的X-VIVO L34氚化精氨酸摄取。精氨酸摄取在整个实验和活肱骨中线性增加。

煮沸的肱骨在实验中没有表现出精氨酸摄取的动态增加。代表性分析显示标准化和校正的精氨酸摄取。将对侧骨煮沸作为主动对照很重要。

此步骤至关重要，因为骨基质可能会吸收放射性氨基酸，从而导致结果不准确。该协议使我们能够确认体外和体内氨基酸摄取动力学。