Amino asit alımı ve metabolizması, osteoblast spesifikasyonu, farklılaşması ve kemik oluşumu için gereklidir. Bu protokol, amino asit alımını değerlendirmek için hızlı ve hassas bir yöntem sağlar. Protokolümüz, amino asit alımını ölçmek için radyoaktif etiketli amino asitler kullanır.
Farklı koşullar için kolayca değiştirilebilen ucuz, hassas ve hızlı bir yöntemdir. Bu protokol, çeşitli dokularda glikoz ve yağ asitleri gibi diğer radyoaktif etiketli besinlerin yanı sıra birincil veya dönüştürücü hücrelerin alımını değerlendirmek için kolayca değiştirilebilir. FBS, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş alfa MEM ortamında 12 kuyucuklu doku kültürü plakasının her bir kuyucuğundaki dördüncü ST2 hücrelerine beş kez 10 ila dördüncü ST2 hücresi amino asit alım plakasına başlamak için.
Normalizasyonlar için koşul başına hücre sayısını ölçmek için hücrelerin ekstra kuyucuklarını plakalayın. Daha sonra, nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründeki hücreleri, birleşene kadar iki ila üç gün boyunca% 5 karbondioksit ile% 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra ortamı aspire edin ve hücreleri pH 7.4'te bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın.
Daha sonra hücreleri bir mililitre Krebs-Ringer'ın HEPES veya KRH ile bir kez yıkamadan önce PBS'yi aspire edin. Mililitre L34 tritiated glutamin çalışma ortamı başına dört mikrokür içeren 0.5 mililitre taze hazırlanmış KRH içeren hücreleri beş dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sonrası, sıvı atık kabına dağıtmak için radyoaktif ortamı toplayın.
Daha sonra reaksiyonu sonlandırmak için hücreleri üç kez buz gibi soğuk KRH ile yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa bir mililitre% 1 sodyum dodesil sülfat ekleyin ve hücreleri lize etmek ve homojenize etmek için karışımı 10 kez tritüre edin. Daha sonra hücre lizatlarını 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca minimum 10.000 G hızında santrifüj yaparak lizatı netleştirin.
Süpernatantı sekiz mililitre sintilasyon çözeltisi içeren bir sintilasyon şişesine aktarın ve sintilasyon sayacını kullanarak radyo aktivitesini ve dakika başına sayımları okuyun. Kalan radyoaktif olmayan hücre plakalarından, lize radyoaktif kültürlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için hücreleri tripsinize edin, yeniden askıya alın ve sayın. Bir hemasitometre kullanarak, her deneysel durum için radyoaktif olmayan kuyu başına hücre sayısını sayın.
Amino asit alımını belirlemek için, kemik milini tartmadan önce kemik iliğini kemikten temizleyin. Kemiği desellülarize etmek için, PBS'de bir humerusu 100 santigrat derecede 10 dakika kaynatın. Hem canlı hem de haşlanmış humeri'yi, hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir mililitre KRH içinde dengeleyin.
Daha sonra, deneysel ve haşlanmış kontrol kemiklerini, mililitre L234 trisiye arginin başına dört mikro köri içeren taze hazırlanmış KRH'de ayrı ayrı 37 santigrat derecede 90 dakikaya kadar inkübe edin. Radyoaktif ortamı çıkardıktan sonra, humerusu bir mililitre buz gibi soğuk KRH ile üç kez yıkayarak reaksiyonu sonlandırın. Her kemiği 500 mikrolitre RIPA Tamponu ile 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Daha sonra humerus ve RIPA Buffer'ı makasla 100 kez doğrayarak homojenleştirin, ardından% 35 genlikte sonikasyon ve 10 saniye boyunca bir saniye nabız izleyin. Lisat, oda sıcaklığında 10.000 kez G'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile berraklaştırıldı. Santrifüjleme sonrası, süpernatantın 200 mikrolitresini, sekiz mililitre sintilasyon çözeltisi içeren sintilasyon şişelerine aktarın.
Parıltı sayacını kullanarak radyo etkinliğini okuyun. İn vitro L34 tritiated glutamin alımı ve konfluent ST2 hücrelerinin kinetik özellikleri, sodyum metil amino izobütirik asit veya lityum varlığında veya yokluğunda değerlendirildi. Sodyumun uzaklaştırılması, glutamin alımında% 90'lık bir azalmaya yol açtı.
Lityumun varlığı, sodyum içermeyen duruma kıyasla glutamin alımını% 2 oranında arttırdı. Oysa metil amino izobütirik asit glutamin alımını etkilemedi. Sistem A, N, L veya ASC ve gama artı L'nin tahmin yüzdesi katkıları, çoğu glutamin alımının ASC sistemleri tarafından aracılık edildiğini ve gama artı L.Sistem N'nin kabaca% 2 sodyum bağımlı glutamin alımından sorumlu olduğunu göstermiştir.
Ve sistem A% 0 katkı ve alım gösterdi. X-VIVO L34 haşlanmış ve canlı yenidoğan humerisinde tritiated arginin alımı iki saatlik bir süre boyunca analiz edildi. Arginin alımı deney boyunca doğrusal olarak artmış ve humeri yaşamıştır.
Haşlanmış humeri, deneyde arginin alımında dinamik bir artış göstermedi. Temsili analiz, normalleştirilmiş ve düzeltilmiş arginin alımını gösterir. Kontralateral kemiğin aktif bir kontrol olarak kaynatılması önemlidir.
Bu adım, kemik matrisi radyoaktif amino asitleri emebileceği ve yanlış sonuçlara neden olabileceği için gereklidir. Protokol, amino asit alım kinetiğini hem in vitro hem de in vivo olarak doğrulamamıza izin verdi.
