Поглощение аминокислот и метаболизм необходимы для конкрементации остеобластов, дифференцировки и формирования костей. Этот протокол обеспечивает быстрый и чувствительный метод оценки поглощения аминокислот. Наш протокол использует радиомаркированные аминокислоты для количественной оценки поглощения аминокислот.
Это дешевый, чувствительный и быстрый метод, который можно легко модифицировать для различных условий. Этот протокол может быть легко модифицирован для оценки поглощения других радиоактивных меток питательных веществ, таких как глюкоза и жирные кислоты, в различных тканях, а также первичных или трансформируемых клетках. Для начала забора аминокислот пластина для анализа пять раз от 10 до четвертой клетки ST2 в каждой лунке из 12 лунок тканевой культуральной пластины в альфа-MEM среде, дополненной FBS, пенициллином и стрептомицином.
Пластинчатые дополнительные колодцы ячеек для количественной оценки количества ячеек для каждого условия для нормализации. Затем инкубируют клетки в увлажненном инкубаторе клеточной культуры при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в течение двух-трех дней до слияния. После инкубации аспирируют среду и дважды промывают клетки одним миллилитром PBS при рН 7,4.
Затем аспирируйте PBS перед тем, как промыть клетки один раз с помощью одного миллилитра HEPES или KRH Кребса-Рингера. Инкубируйте клетки с 0,5 миллилитрами свежеприготовленного KRH, содержащего четыре микрокюри на миллилитр L34 тритиированной рабочей среды глутамина в течение пяти минут. После инкубации соберите радиоактивную среду для дозирования в контейнер для жидких отходов.
Затем промыть клетки три раза ледяным холодом КРГ, чтобы прекратить реакцию. Затем добавьте один миллилитр 1% додецилсульфата натрия в каждую лунку и тритурируйте смесь 10 раз, чтобы лизировать и гомогенизировать клетки. Затем переложите лизаты клеток в 1,5-миллилитровую трубку и осветлите лизат центрифугированием с минимальной скоростью 10 000 G в течение 10 минут.
Перенесите супернатант в сцинтилляционный флакон, содержащий восемь миллилитров сцинтилляционного раствора, и считывайте радиоактивность и подсчеты в минуту с помощью сцинтилляционного счетчика. Из оставшихся нерадиоактивных пластин клеток трипсинизируют, повторно суспендируют и подсчитывают клетки, чтобы оценить количество клеток в лизированных радиоактивных культурах. Используя гемацитометр, подсчитайте количество клеток на нерадиоактивную скважину для каждого экспериментального состояния.
Чтобы определить поглощение аминокислот, вымывайте костный мозг из кости перед взвешиванием костного стержня. Чтобы децеллюляризировать кость, вскипятите одну плечевую кость в PBS при 100 градусах Цельсия в течение 10 минут. Уравновешивайте как живую, так и кипяченую плечевую кость в одном миллилитре КРГ в течение 30 минут в инкубаторе клеточных культур при 37 градусах Цельсия.
Затем инкубируют экспериментальные и вареные контрольные кости отдельно в свежеприготовленном KRH, содержащем четыре микросу на миллилитр L234 трициированного аргинина в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия. После удаления радиоактивной среды прекращают реакцию, промыв плечевую кость три раза одним миллилитром ледяного холодного КРГ. Переведите каждую кость в 1,5-миллилитровую трубку с 500 микролитрами ripa Buffer.
Затем гомогенизируйте плечевую кость и буфер RIPA, измельчив ножницами 100 раз, с последующим обработкой ультразвуком с амплитудой 35% и одним секундным импульсом в течение 10 секунд. Осветляют лизат центрифугированием в течение 10 минут при 10 000 g при комнатной температуре. После центрифугирования перенести 200 микролитров супернатанта в сцинтилляционные флаконы, содержащие восемь миллилитров сцинтилляционного раствора.
Считывание радиоактивности с помощью сцинтилляционного счетчика. Кинетические свойства in vitro L34 тритиированного поглощения глутамина и сливающихся st2 клеток оценивали в присутствии или отсутствии метиламиномасляной кислоты натрия или лития. Удаление натрия привело к снижению поглощения глютамина на 90%.
Присутствие лития увеличивало поглощение глютамина на 2% по сравнению с состоянием без натрия. В то время как метиламиносомасляная кислота не влияла на поглощение глютамина. Оценка процентных вкладов системы A, N, L или ASC и гамма плюс L показала, что большая часть поглощения глутамина опосредована системами ASC и гамма плюс L.Система N отвечает примерно за 2%-зависимое поглощение глутамина натрия.
А система А показала 0% вклада и поглощения. Поглощение тритиированного аргинина X-VIVO L34 в кипяченой и живой неонатальной плечевой кости анализировалось в течение двух часов. Поглощение аргинина увеличивалось линейно на протяжении всего эксперимента и живой плечевой кости.
Кипяченая плечевая кишка не проявляла динамического увеличения поглощения аргинина в эксперименте. Репрезентативный анализ показывает нормализованное и скорректированное поглощение аргинина. Важно кипятить контралатеральную кость в качестве активного контроля.
Этот шаг имеет важное значение, так как костный матрикс может поглощать радиоактивные аминокислоты, что приводит к неточным результатам. Протокол позволил нам подтвердить кинетику поглощения аминокислот как in vitro, так и in vivo.
