Aminosäureaufnahme und Stoffwechsel sind essentiell für die Osteoblastenspezifikation, Differenzierung und Knochenbildung. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und empfindliche Methode zur Bewertung der Aminosäureaufnahme. Unser Protokoll verwendet radioaktiv markierte Aminosäuren, um die Aminosäureaufnahme zu quantifizieren.
Es ist eine billige, empfindliche und schnelle Methode, die leicht für verschiedene Bedingungen modifiziert werden kann. Dieses Protokoll kann leicht modifiziert werden, um die Aufnahme anderer radioaktiv markierter Nährstoffe wie Glukose und Fettsäuren in einer Vielzahl von Geweben sowie in Primär- oder Transformationszellen zu bewerten. Zu Beginn der Aminosäureaufnahme Assay-Platte fünfmal 10 bis zum vierten ST2-Zellen in jeder Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte in alpha-MEM-Medium ergänzt mit FBS, Penicillin und Streptomycin.
Plate zusätzliche Vertiefungen von Zellen, um die Zellzahl pro Bedingung für die Normalisierungen zu quantifizieren. Als nächstes inkubieren Sie Zellen in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für zwei bis drei Tage, bis sie konfluieren. Nach der Inkubation saugen Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter PBS bei pH 7,4.
Dann saugen Sie das PBS ab, bevor Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter Krebs-Ringer-HEPES oder KRH waschen. Inkubieren Sie Zellen mit 0,5 Milliliter frisch zubereitetem KRH mit vier Mikrocuries pro Milliliter L34 tritiiertem Glutamin-Arbeitsmedium für fünf Minuten. Nach der Inkubation das radioaktive Medium sammeln, um es in den flüssigen Abfallbehälter zu geben.
Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem KRH, um die Reaktion zu beenden. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter 1% Natriumdodecylsulfat zu jeder Vertiefung hinzu und trituieren Sie die Mischung 10 mal, um die Zellen zu lysieren und zu homogenisieren. Dann werden die Zelllysate in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und das Lysat durch Zentrifugieren bei einer Mindestgeschwindigkeit von 10.000 G für 10 Minuten geklärt.
Übertragen Sie den Überstand in ein Szintillationsfläschchen, das acht Milliliter der Szintillationslösung enthält, und lesen Sie Radioaktivität und -zählungen pro Minute mit dem Szintillationszähler ab. Aus den verbleibenden nicht-radioaktiven Zellplatten trypsinisieren, resuspendieren und zählen Sie die Zellen, um die Anzahl der Zellen in den lysierten radioaktiven Kulturen zu schätzen. Zählen Sie mit einem Hämazytometer die Anzahl der Zellen pro nicht-radioaktiver Vertiefung für jede experimentelle Bedingung.
Um die Aminosäureaufnahme zu bestimmen, spülen Sie das Mark aus dem Knochen aus, bevor Sie den Knochenschaft wiegen. Um den Knochen zu dezellularisieren, kochen Sie einen Humerus in PBS bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten. Equilibrieren Sie sowohl lebende als auch gekochte Humeri in einem Milliliter KRH für 30 Minuten im Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius.
Als nächstes inkubieren Sie die experimentellen und gekochten Kontrollknochen separat in frisch zubereitetem KRH, das vier Mikrocurrys pro Milliliter L234-triziiertem Arginin enthält, für bis zu 90 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach dem Entfernen des radioaktiven Mediums beenden Sie die Reaktion, indem Sie den Humerus dreimal mit einem Milliliter eiskaltem KRH waschen. Übertragen Sie jeden Knochen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 500 Mikrolitern RIPA-Puffer.
Dann homogenisieren Sie den Humerus und den RIPA-Puffer, indem Sie 100 Mal mit einer Schere hacken, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung bei 35% Amplitude und einem Sekundenimpuls für 10 Sekunden. Das Lysat wird durch Zentrifugieren für 10 Minuten bei 10.000 mal G bei Raumtemperatur geklärt. Nach der Zentrifugation werden 200 Mikroliter des Überstands in Szintillationsfläschchen überführt, die acht Milliliter der Szintillationslösung enthalten.
Lesen Sie die Radioaktivität mit dem Szintillationszähler. Kinetische Eigenschaften von in vitro L34 tritiierter Glutaminaufnahme und konfluierenden ST2-Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Natriummethylaminoisobuttersäure oder Lithium bewertet. Die Entfernung von Natrium führte zu einer 90%igen Reduktion der Glutaminaufnahme.
Das Vorhandensein von Lithium erhöhte die Glutaminaufnahme um 2% im Vergleich zum natriumfreien Zustand. Während Methylaminoisobuttersäure die Glutaminaufnahme nicht beeinflusste. Die geschätzten prozentualen Beiträge von System A, N, L oder ASC und gamma plus L zeigten, dass der größte Teil der Glutaminaufnahme durch die Systeme ASC und gamma plus L vermittelt wird.System N ist für eine etwa 2%ige natriumabhängige Glutaminaufnahme verantwortlich.
Und System A zeigte einen Beitrag und eine Akzeptanz von 0%. Die Aufnahme von X-VIVO L34 tritiiertem Arginin in gekochten und lebenden neonatalen Humeri wurde über einen Zeitraum von zwei Stunden analysiert. Die Argininaufnahme nahm während des gesamten Experiments linear zu und lebte Humeri.
Die gekochten Humeri zeigten im Experiment keinen dynamischen Anstieg der Argininaufnahme. Die repräsentative Analyse zeigt die normalisierte und korrigierte Argininaufnahme. Es ist wichtig, den kontralateralen Knochen als aktive Kontrolle zu kochen.
Dieser Schritt ist wichtig, da die Knochenmatrix radioaktive Aminosäuren absorbieren kann, was zu ungenauen Ergebnissen führt. Das Protokoll hat es uns ermöglicht, die Aminosäureaufnahmekinetik sowohl in vitro als auch in vivo zu bestätigen.
