A absorção e o metabolismo de aminoácidos são essenciais para a especificação, diferenciação e formação óssea de osteoblastos. Este protocolo fornece um método rápido e sensível para avaliar a absorção de aminoácidos. Nosso protocolo usa aminoácidos radiomarcados para quantificar a absorção de aminoácidos.
É um método barato, sensível e rápido que pode ser facilmente modificado para diferentes condições. Este protocolo pode ser facilmente modificado para avaliar a absorção de outros nutrientes radiomarcados como glicose e ácidos graxos em uma variedade de tecidos, bem como células primárias ou transformadas. Para iniciar a placa de ensaio de absorção de aminoácidos cinco vezes 10 para a quarta célula ST2 em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços em meio alfa MEM suplementado com FBS, penicilina e estreptomicina.
Placa de poços extras de células para quantificar o número de células por condição para as normalizações. Em seguida, incube as células em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por dois a três dias até ficar confluente. Após incubação aspirar o meio e lavar as células duas vezes com um mililitro de PBS a pH 7,4.
Em seguida, aspirar o PBS antes de lavar as células uma vez com um mililitro de Krebs-Ringer HEPES ou KRH. Incubar células com 0,5 mililitros de KRH recém-preparado contendo quatro microcuries por mililitro L34 tritiada glutamina durante cinco minutos. Após a incubação, colete o meio radioativo para dispensar no recipiente de resíduos líquidos.
Em seguida, lave as células três vezes com KRH gelado para encerrar a reação. Em seguida, adicione um mililitro de dodecil sulfato de sódio a 1% a cada poço e triture a mistura 10 vezes para lisar e homogeneizar as células. Em seguida, transfira os lisados celulares para um tubo de 1,5 mililitro e esclareça o lisado centrifugando a uma velocidade mínima de 10.000 G por 10 minutos.
Transfira o sobrenadante para um frasco para injetáveis de cintilação contendo oito mililitros da solução de cintilação e leia a atividade de rádio e as contagens por minuto utilizando o contador de cintilação. A partir das placas não radioativas restantes das células, tripsinize, ressuspenda e conte as células para estimar o número de células nas culturas radioativas lisadas. Usando um hemacitômetro, conte o número de células por poço não radioativo para cada condição experimental.
Para determinar a absorção de aminoácidos, lave a medula do osso antes de pesar o eixo ósseo. Para descelularizar o osso, ferva um úmero em PBS a 100 graus Celsius por 10 minutos. Equilibre os úmeros vivos e cozidos em um mililitro de KRH por 30 minutos na incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius.
Em seguida, incube os ossos de controle experimentais e cozidos separadamente em KRH recém-preparado contendo quatro microcaril por mililitro de arginina triciada L234 por até 90 minutos a 37 graus Celsius. Depois de remover o meio radioativo, termine a reação lavando o úmero três vezes com um mililitro de KRH gelado. Transfira cada osso para um tubo de 1,5 mililitro com 500 microlitros de buffer RIPA.
Em seguida, homogeneize o úmero e o tampão RIPA cortando 100 vezes com uma tesoura, seguido de sonicação a 35% de amplitude e um segundo de pulso por 10 segundos. Clarificado o lisado por centrifugação durante 10 minutos a 10.000 vezes G à temperatura ambiente. Após a centrifugação, transferir 200 microlitros do sobrenadante para frascos de cintilação contendo oito mililitros da solução de cintilação.
Leia a atividade de rádio usando o contador de cintilação. As propriedades cinéticas da captação de glutamina tritiada in vitro L34 e das células ST2 confluentes foram avaliadas na presença ou ausência de ácido metil aminoisobutírico ou lítio. A remoção de sódio levou a uma redução de 90% na absorção de glutamina.
A presença de lítio aumentou a absorção de glutamina em 2% em comparação com a condição livre de sódio. Considerando que o ácido metil aminoisobutírico não afetou a absorção de glutamina. As contribuições percentuais de estimação do sistema A, N, L ou ASC e gama mais L indicaram que a maior parte da absorção de glutamina é mediada pelos sistemas ASC e gama mais L.O sistema N é responsável por aproximadamente 2% de absorção de glutamina dependente de sódio.
E o sistema A mostrou 0% de contribuição e absorção. A captação de arginina tritiada X-VIVO L34 em úmeros neonatais cozidos e vivos foi analisada ao longo de um período de tempo de duas horas. A absorção de arginina aumentou linearmente ao longo do experimento e do úmero vivo.
Os úmeros cozidos não apresentaram aumento dinâmico da captação de arginina no experimento. A análise representativa mostra a captação de arginina normalizada e corrigida. É importante ferver o osso contralateral como um controle ativo.
Esta etapa é essencial, pois a matriz óssea pode absorver aminoácidos radioativos, resultando em resultados imprecisos. O protocolo nos permitiu confirmar a cinética de absorção de aminoácidos tanto in vitro quanto in vivo.
