ספיגת חומצות אמינו וחילוף חומרים חיוניים למפרט אוסטאובלסט, התמיינות ויצירת עצם. פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ורגישה להערכת ספיגת חומצות אמינו. הפרוטוקול שלנו משתמש בחומצות אמינו מסומנות ברדיו כדי לכמת את ספיגת חומצות האמינו.
זוהי שיטה זולה, רגישה ומהירה אשר ניתן לשנות בקלות עבור תנאים שונים. פרוטוקול זה יכול להשתנות בקלות כדי להעריך את ספיגתם של חומרים מזינים אחרים עם תווית רדיו כמו גלוקוז וחומצות שומן במגוון רקמות, כמו גם תאים ראשוניים או טרנספורמטיביים. כדי להתחיל קליטת חומצות אמינו צלחת בדיקה חמש פעמים 10 לתאי ST2 הרביעי בכל באר של צלחת תרבית רקמה 12 באר במדיום אלפא MEM בתוספת FBS, פניצילין וסטרפטומיצין.
צלחת בארות נוספות של תאים כדי לכמת את מספר התא לכל תנאי עבור הנורמליזציות. לאחר מכן, דגירה של תאים בחממה של תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך יומיים-שלושה עד למפגש. לאחר הדגירה לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS ב pH 7.4.
לאחר מכן שאפו את ה- PBS לפני שטיפת התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של קרבס-רינגר HEPES או KRH. דגירה של תאים עם 0.5 מיליליטר של KRH מוכן טרי המכיל ארבע מיקרוקוריות למיליליטר L34 טריטמין מדיה עובד במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, לאסוף את המדיום הרדיואקטיבי כדי לזרום לתוך מיכל פסולת נוזלית.
לאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים עם KRH קר כקרח כדי לסיים את התגובה. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של 1% נתרן דודציל סולפט לכל באר triturate את התערובת 10 פעמים כדי lyse ו homogenize התאים. לאחר מכן להעביר את התא lysates לצינור 1.5 מיליליטר ולהבהיר את ליזאט על ידי צנטריפוגה במהירות מינימלית של 10, 000 G במשך 10 דקות.
מעבירים את הסופרנאטנט לבקבוקון scintillation המכיל שמונה מיליליטר של תמיסת ה-Scintillation, וקוראים את פעילות הרדיו ואת הספירות לדקה באמצעות מונה ה-scintillation. מתוך שאר הצלחות הלא רדיואקטיביות של התאים, טריפסיניזציה, החייאה וספירת התאים כדי להעריך את מספר התאים בתרביות הרדיואקטיביות המזוהמות. באמצעות המציטומטר, לספור את מספר התאים לכל באר לא רדיואקטיבית עבור כל מצב ניסיוני.
כדי לקבוע ספיגת חומצות אמינו, יש לשטוף את המח מהעצם לפני שקילת פיר העצם. כדי לנטרל את העצם, מרתיחים הומרוס אחד ב-PBS ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שיווי משקל הן humeri חי מבושל במיליליטר אחד של KRH במשך 30 דקות באינקובטור תרבית תאים ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, דגרו את עצמות הבקרה הניסיוניות והמבושלות בנפרד ב-KRH שהוכן זה עתה, המכילות ארבע מיקרו-קורי למיליליטר L234 טריגינין למשך עד 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת המדיום הרדיואקטיבי, לסיים את התגובה על ידי שטיפת humerus שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של KRH קר כקרח. מעבירים כל עצם לצינור של 1.5 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של RIPA Buffer.
לאחר מכן הומוגניים של ההומרוס וחיץ RIPA על ידי חיתוך 100 פעמים עם מספריים, ולאחר מכן סוניקציה באמפליטודה של 35% ופעימה של שנייה אחת למשך 10 שניות. הבהיר את הליזאט על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10, 000 פעמים G בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, העבירו 200 מיקרוליטרים של הסופר-נטנט לבקבוקוני ה-Scintillation המכילים שמונה מיליליטרים של תמיסת ה-Scintillation.
קרא את פעילות הרדיו באמצעות מונה הסינטילציה. תכונות קינטיות של ספיגת גלוטמין משולשת במבחנה L34 ותאי ST2 מקבילים הוערכו בנוכחות או בהיעדר נתרן מתיל אמינו איזובוטירי חומצה או ליתיום. הסרת הנתרן הובילה לירידה של 90% בספיגת גלוטמין.
נוכחות ליתיום הגדילה את ספיגת הגלוטמין ב-2% בהשוואה למצב ללא נתרן. ואילו חומצה איזובוטירית מתיל אמינו לא השפיעה על ספיגת הגלוטמין. אחוז התרומות של מערכת A, N, L או ASC וגמא פלוס L הצביע על כך שרוב ספיגת הגלוטמין מתווכת על ידי מערכות ASC וגמא בתוספת L.System N אחראית לספיגת גלוטמין תלוית נתרן בערך 2%.
ומערכת א' הראתה 0% תרומה וספיגה. X-VIVO L34 טריטיזציה ספיגת ארגינין בהאמרי ילודים מבושלים וחיים נותחה במשך זמן של שעתיים. ספיגת הארגינין עלתה באופן ליניארי במהלך הניסוי והומרי חי.
ההומרי המבושל לא הפגין עלייה דינמית בספיגת ארגינין בניסוי. הניתוח המייצג מראה את ספיגת הארגינין המנורמלת והמתוקנת. חשוב להרתיח את העצם הקונטרלטרלית כבקרה פעילה.
שלב זה חיוני מכיוון שמטריצת העצם עלולה לספוג חומצות אמינו רדיואקטיביות, וכתוצאה מכך תוצאות לא מדויקות. הפרוטוקול אפשר לנו לאשר קינטיקה של ספיגת חומצות אמינו הן במבחנה והן ב- in vivo.
