基于显微镜的测定，使用SNARE运输来研究和分析回收内体。这些是皮肤黑素细胞。你在细胞内看到的黑色细胞器被称为黑素体。
黑素体被称为一类称为溶酶体相关细胞器或LRO的细胞器。回收内体是来自所有细胞类型的早期或分类内体的管状囊泡细胞器。这些细胞器在黑色素体的生物发生中起关键作用，黑素体是由黑素细胞产生的溶酶体相关细胞器。
回收内体在形成过程中将黑素细胞特异性货物输送到过早的黑素体。在几种综合征中观察到的循环内体的产生是皮肤，头发和眼睛色素沉着过度的细胞。因此，研究循环内体的动力学有助于了解这些细胞器在正常和疾病条件下的功能。
本研究旨在使用阻止SNARE语法in-13来测量循环内体的动力学。第一步是在预处理的盖玻片上接种小鼠黑素细胞。将玻璃盖玻片涂在基底膜基质介质的培养皿中。
并在组织培养罩中干燥15分钟。使用前用1X PBS清洗盖玻片一次。在基底膜介质上接种细胞，以50%至60%的能力接种盖玻片。
始终在完整的RPMI培养基中向电镀的细胞悬浮液中加入200纳摩尔的PMA。接种细胞后，将含有细胞的培养皿在CO2培养箱中孵育12至24小时。第二步是用语法蛋白-13质粒转染细胞。
孵育含有DNA和转染试剂的吸头，混合五分钟，无需重复移液。在室温下，每10分钟用手敲击管子30分钟。在孵育期间，用1X PBS洗涤细胞两次，一次用OPTI-MEM洗涤细胞，然后向细胞中加入1密耳的OPTI-MEM。
孵育30分钟后，通过覆盖培养皿以滴滴方式将转染试剂DNA混合物加入细胞中。将细胞在37摄氏度下孵育六个小时。用转染试剂吸出OPTI-MEM培养基，并加入补充200纳摩尔PMA的完整RPMI培养基。
将细胞在37摄氏度下孵育48小时。第三步是细胞的固定。请注意，以下程序在组织培养罩外进行。
转染48小时后，用1X PBS洗涤细胞两次，然后用3%甲醛固定细胞30分钟。固定后，用1X PBS洗涤细胞两次，并将盖玻片储存在1X PBS中直至进一步使用。或者，电池可以安装在玻璃板上或储存在四摄氏度。
第四步是细胞的免疫染色。准备一个潮湿的腔室。将石膏膜切割片放在培养皿中的鼠标滤纸上。
盖上铝箔。制备25微升一抗溶液。以1至200的稀释液加入抗体。
将此溶液作为滴剂添加到潮湿室中的parafilm上。用镊子小心地抬起盖玻片。将其倒置在一抗染色液的滴上，然后盖上潮湿室的盖子。
在室温下孵育30分钟。同样，以1至500的稀释度制备二抗溶液，并将其放在潮湿室盖玻片旁边的副膜上。为了染色细胞核，以120，000至130，000的稀释度向溶液中加入DAPI。
使用镊子，小心地从一抗溶液中取出盖玻片，并将其浸入1X PBS中两次。轻触薄纸上的盖玻片，以清除盖玻片上多余的PBS。将其放在潮湿室中的二抗染色溶液上，并且由于溶液中存在荧光染色抗体，因此不要将其暴露在光线下。
孵育后，小心地从二抗溶液中取出盖玻片，然后将其浸入1X PBS中两次。此外，点击薄纸上的盖玻片以除去盖玻片上多余的PBS。将12微升成像试剂放在载玻片上，并小心地将染色的盖玻片放在安装试剂上。
倒置薄纸上的载玻片，然后轻轻按压。接下来，使用荧光显微镜对盖玻片进行成像，并使用ImageJ分析图像。第六步是定量回收内体局部蛋白质和黑素体之间的重叠。
用黑素体定量语法蛋白-13 delta-129共定位。小鼠野生型黑素细胞中 syntaxin-13 的免疫荧光显微镜检查显示 GFP-syntaxin-13 野生型定位为囊泡和管状结构。GFP-syntaxin-13 delta-129除了细胞表面外，还定位环状结构。
此外，细胞内环状GFP-syntaxin-13 delta-129在明场成像的黑素体中显示出与黑素体蛋白TYRP1的共定位。如前所述，在黑素体中观察到一组过度表达的GFP-syntaxin-13野生型。为了测量GFP-syntaxin-13野生型和GFP-syntaxin-13 delta-129对黑素体的相对定位，使用斐济软件并使用JACOP插件进行了分析。
与具有TYRP1的GFP-syntaxin-13野生型相比，测量的Mander重叠系数（即MOC）与具有TYRP1的GFP-syntaxin-13 wild类型相比高出约1.5倍。有趣的是，与GFP-syntaxin-13 wild类型相比，TYRP1的GFP-syntaxin-13 delta-129的MOC值高出2.9倍。这些数据表明，在稳态下，GFP-syntaxin-13 delta-129黑素体的定位相对高于GFP-syntaxin-13野生型。
定量synan-13野生型定位的回收内体。GFP-syntaxin-13野生型的免疫荧光显微镜检查显示与已知的循环内体蛋白Rab11共定位。与具有GFP-syntaxin-13野生型的mCherry-Rab11相比，具有mCherry-Rab11的GFP-syntaxin-13野生型之间的MOC大约高出1.4倍。
为了测量GFP-syntaxin-13野生型阳性内体小管的数量和长度，使用了斐济软件，如方案部分所述。mCherry-Rab11在实验中使用阳性对照。与表达mCherry-Rab11的细胞相比，转染GFP-syntaxin-13野生型的黑素细胞显示出每个细胞的肾小管数量更多。
然而，当细胞中GFP-syntaxin-13野生型和mCherry-Rab11共表达时，肾小管减少。第七步是定量回收内体的管状数量和长度。当细胞中GFP-syntaxin-13野生型和mCherry-Rab11共表达时，肾小管减少。
有趣的是，GFP-syntaxin-13野生型和mCherry-Rab11的平均肾小管长度在单独或一起表达的细胞中彼此相当。总之，这些数据表明GFP-syntaxin-13野生型定位为与Rab11相似的回收内体。这项研究表明，syntaxin-13突变体的N端递送，即GFP-syntaxin-13 delta-129，定位于黑素体GFP-syntaxin-13 delta-129可以用作从循环内体到细胞表面和LRO的水泡运输的报告。
相比之下，GFP-syntaxin-13野生型定位为与Rab11相似的循环内体。本研究表明，GFP-syntaxin-13野生型也可用于标记黑素细胞中的循环内体。GFP-syntaxin-13野生型可能比Rab11更好地回收内体标记，因为Rab11改变了内体动力学。
总而言之，GFP-syntaxin-13野生型作为潜在的回收内体标记，以研究稳态条件下的动力学。
