该协议很重要，因为它提供了一种以高度可重复的方式从各种细菌中分离细胞外囊泡的方法。这项技术的伟大之处在于它可以用来从相当大的细菌培养环境中分离EV，这将使体内研究成为可能。虽然我们显示的数据反映了临床前应用，但可以预见的是，该方案可以适用于制造用于治疗的细菌EV。
该方法只需稍作修改即可应用于任何可扩展的细胞培养系统。由于方案的可扩展性，重要的是拥有适当尺寸的过滤器和SEC色谱柱来处理所需的细菌细胞培养起始体积。演示这些程序的是Justin Lathia博士实验室的助理技术专家Sadie Johnson，Justin Lathia博士实验室的肿瘤学研究员Dionysius Watson和我实验室的研究技术专家Akeem Santos。
首先使用无菌环将单个大肠杆菌菌落接种到 250 至 1000 毫升 Luria-Bertani 或 LB 肉汤中。然后，在振荡培养箱中以每分钟300转和37摄氏度的速度有氧孵育培养物。孵育48小时后，通过将细胞培养物转移到干净的500毫升聚丙烯离心瓶中澄清细菌培养基，以4摄氏度和5， 000倍G的大容量固定角转子离心15分钟。
将上清液转移到干净的离心瓶中，小心地倒入以10， 000倍G离心15分钟。接下来，将上清液转移到适当尺寸的0.2微米聚醚砜真空驱动过滤装置中，并将过滤装置连接到真空壁供应。如果过滤速率显着下降，请将未过滤的材料移至新设备。
过滤后的培养基可以在四摄氏度下储存过夜，也可以立即进一步处理。为了检查活细胞的完全去除，将过滤上清液的等分试样铺在合适的琼脂平板上，并确保在细菌菌株的最佳条件下孵育后没有任何菌落。为了浓缩体积为100毫升的过滤培养基，将90毫升过滤培养基装入具有100千道尔顿分子量截止值的离心超滤装置的储液器中，并将培养基在水平桶转子中以4摄氏度和2， 000倍G离心15至30分钟间隔，直到顶部储液罐的体积浓缩至小于0.5毫升。
要用任何剩余的过滤培养基填充储液器，请去除设备底部的流出物以重新平衡。如果储液槽中浓缩培养基的粘度明显增加，则用PBS稀释培养基并通过离心重新浓缩，以减少小于分子量截止值100千道尔顿的任何非细胞外囊泡或EV蛋白。然后，将浓缩培养基转移到低蛋白结合管中，在四摄氏度下储存过夜 为了浓缩体积大于100毫升的过滤介质，请选择适当尺寸的切向流过滤或TFF装置，截止分子量为100千道尔顿。
按照手稿中的说明组装过滤回路后，将200毫升PBS泵入刻度容器中，以确定与所需流速相对应的适当速度。当设定速度时，在室温下以每分钟约200毫升的速度循环过滤的条件培养基，并收集小于100千道尔顿的分子，在单独的容器中作为废物穿过超滤膜，直到条件培养基的体积减少到100至200毫升。依次用PBS将过滤后的体积稀释两倍，并继续用泵在较小的容器中循环培养基，使体积浓缩至75至100毫升，然后浓缩至25毫升和10毫升。
将进料管从样品储液罐中取出并泵送以吹扫过滤器以回收最大量的样品。将浓缩样品移至分子量截止值为100千道尔顿的15毫升离心超滤装置中，并在4摄氏度和2， 000倍G的摆动桶转子中离心15至30分钟间隔，直到顶部储液器中的培养基体积小于2毫升。将浓缩培养基转移到低蛋白结合管中，在 4 摄氏度下储存过夜。
对于EV的分离，使用具有10 mL床体积的小色谱柱进行体积排阻色谱或SEC，用于少于100毫升的起始材料，使用具有47 mL床体积的较大色谱柱用于超过100毫升的起始材料。在实验前几个小时内，将SEC色谱柱和PBS置于室温，然后使用标准实验室支架和支架将色谱柱稳定在垂直位置。在连接到SEC色谱柱之前，通过让5毫升PBS通过筛板流入废物容器来水合样品储液槽。
然后，拧下色谱柱的入口盖，向样品储液槽中加入两毫升PBS，并在PBS通过筛板滴出时小心地将储液槽连接到色谱柱。为了平衡色谱柱，向样品储液槽中加入47毫升PBS，然后打开SEC色谱柱的底部。然后，允许所有上样的样品缓冲液流过色谱柱并丢弃流出液。
将两毫升样品加载到样品储液槽中后，让样品完全进入色谱柱并收集流出物。立即将PBS以14.25毫升的体积减去样品体积添加到样品储液槽中，以使溶液流过色谱柱，同时丢弃等于柱空体积的量。接下来，将一个两毫升低结合微管直接放置在SEC色谱柱下方，以在允许两毫升PBS流过色谱柱后收集第一个流通或分数一。
继续向样品储液槽中加入两毫升PBS，以收集每个后续馏分。将收集的馏分储存在 4 摄氏度下进行短期储存，或将零下 80 摄氏度储存在零下 80 摄氏度下进行长期储存。对于收集的EV级分的无菌测试，用100微升用于测定的级分接种3毫升培养基。
然后，在最佳条件下培养培养基，同时观察浊度至少三天。或者，可以将馏分样品应用于含有用于培养产生细菌的培养基的琼脂平板，然后检查菌落形成。接下来，通过将25%至50%的单个或混合级分转移到零下80摄氏度的低蛋白结合管中来储存EV，以避免冻融循环。
代表性分析显示，大肠杆菌MP1 EV在早期色谱馏分中洗脱。馏分一到六包含的电动汽车最多，平均直径小于100纳米。同时，随后的馏分含有无EV的蛋白质和很少的EV。
透射电子显微镜证实了EV富集和尺寸，特别是在第二至六级。观察到富含EV的级分2至7具有高纳米荧光素酶活性，但与后来的级分相比，来自非EV相关mCherry的荧光信号非常低。免疫金标记证实了纳米荧光素酶在第二至五级份中的EV关联。
通过从各种厌氧细菌的培养物中分离EV来评估该方案对其他细菌物种的适用性。观察到早期色谱级分一到四富集用于EV，直径尺寸小于100纳米。复杂的脑心输注（BHI）含有EV大小的颗粒，不到EV总产量的25%。
重要的是使用能够处理细菌细胞培养起始体积的TFF设备。这种技术使我们能够生成足够的电动汽车，以询问有关它们在复杂动物模型中功能的生物学问题。
