Questo protocollo è importante perché fornisce un modo per isolare le vescicole extracellulari da una varietà di batteri in modo altamente riproducibile. La cosa grandiosa di questa tecnica è che può essere utilizzata per isolare EV da ambienti abbastanza grandi di colture batteriche, il che consentirà studi in vivo. Mentre i dati che mostriamo riflettono le applicazioni precliniche, è prevedibile che questo protocollo potrebbe essere adattato alla produzione di EV batterici per le terapie.
Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema di coltura cellulare scalabile con piccole modifiche. A causa della scalabilità del protocollo, è importante disporre di filtri e colonne SEC di dimensioni appropriate per gestire i volumi iniziali desiderati di coltura cellulare batterica. A dimostrare le procedure sono Sadie Johnson, un assistente tecnologo nel laboratorio del Dr.Justin Lathia, Dionysius Watson, un collega di oncologia nel laboratorio del Dr.Justin Lathia, e Akeem Santos, un tecnologo di ricerca nel mio laboratorio.
Inizia inoculando singole colonie di Escherichia coli in 250-1000 millilitri di Luria-Bertani, o brodo LB, usando un ciclo sterile. Quindi, incubare la coltura aerobicamente in un incubatore vibrante a 300 rotazioni al minuto e 37 gradi Celsius. Dopo 48 ore di incubazione, chiarire il terreno di coltura batterica trasferendo le colture cellulari in bottiglie di centrifuga in polipropilene da 500 millilitri pulite per centrifugare in un rotore ad angolo fisso di grande capacità a quattro gradi Celsius e 5.000 volte G per 15 minuti.
Trasferire il surnatante per pulire le bottiglie della centrifuga versando accuratamente alla centrifuga a 10.000 volte G per 15 minuti. Quindi, trasferire il surnatante a un dispositivo filtrante sottovuoto in polietersulfone da 0,2 micron di dimensioni appropriate e collegare il dispositivo di filtrazione a un'alimentazione a parete sottovuoto. Se la velocità di filtrazione diminuisce in modo significativo, spostare il materiale non filtrato su un nuovo dispositivo.
Il mezzo filtrato può essere conservato a quattro gradi Celsius durante la notte o può essere ulteriormente elaborato immediatamente. Per verificare la completa rimozione delle cellule vitali, distribuire un'aliquota del surnatante filtrato su apposite piastre di agar e garantire l'assenza di colonie dopo l'incubazione in condizioni ottimali per il ceppo batterico. Per concentrare il mezzo filtrato con un volume di 100 millilitri, caricare 90 millilitri di terreno di coltura filtrato sul serbatoio del dispositivo di ultrafiltrazione centrifuga con un cutoff di peso molecolare di 100 kilodalton e centrifugare il mezzo nel rotore della benna oscillante a quattro gradi Celsius e 2.000 volte G per intervalli da 15 a 30 minuti fino a quando il volume del nel serbatoio superiore è stato concentrato a meno di 0,5 millilitri.
Per rabboccare il serbatoio con qualsiasi terreno di coltura filtrato rimanente, rimuovere il flusso nella parte inferiore del dispositivo per ribilanciarlo. Se la viscosità del mezzo concentrato nel serbatoio è visibilmente aumentata, diluire il mezzo con PBS e rifocalizzarlo mediante centrifugazione per ridurre qualsiasi vescicola non extracellulare, o proteine EV, più piccole del limite di peso molecolare di 100 kilodalton. Quindi, trasferire il mezzo concentrato in un tubo legante a basso contenuto proteico per conservare a quattro gradi Celsius durante la notte Per concentrare il mezzo filtrato con un volume superiore a 100 millilitri, selezionare una filtrazione a flusso tangenziale di dimensioni appropriate, o un dispositivo TFF, con un limite di peso molecolare di 100 kilodalton.
Dopo aver assemblato un circuito di filtrazione come spiegato nel manoscritto, pompare 200 millilitri di PBS in un recipiente graduato per determinare la velocità appropriata corrispondente alla portata desiderata. Quando la velocità è impostata, far circolare il mezzo filtrato condizionato a circa 200 millilitri al minuto a temperatura ambiente e raccogliere le molecole più piccole di 100 kilodalton, attraversando la membrana di ultrafiltrazione come rifiuti in un recipiente separato fino a quando il volume del mezzo condizionato è stato ridotto a 100-200 millilitri. Diluire sequenzialmente il volume filtrato due volte con PBS e continuare a far circolare il mezzo con la pompa in recipienti più piccoli per concentrare il volume a 75-100 millilitri, quindi a 25 millilitri e 10 millilitri.
Sollevare il tubo di alimentazione dal serbatoio del campione e pompare per spurgare il filtro per recuperare la quantità massima del campione. Spostare il campione concentrato su un dispositivo di ultrafiltrazione centrifuga da 15 millilitri con cutoff di peso molecolare di 100 kilodalton e centrifugare in un rotore a benna oscillante a quattro gradi Celsius e 2.000 volte G per intervalli da 15 a 30 minuti fino a quando il volume del mezzo nel serbatoio superiore è inferiore a due millilitri. Trasferire il mezzo concentrato in un tubo legante a basso contenuto proteico per conservare a quattro gradi Celsius durante la notte.
Per l'isolamento dei veicoli elettrici, eseguire la cromatografia di esclusione dimensionale, o SEC, utilizzando una piccola colonna con un volume del letto di 10 millilitri per meno di 100 millilitri di materiale di partenza e una colonna più grande con un volume del letto di 47 millilitri per più di 100 millilitri di materiale di partenza. Per diverse ore prima dell'esperimento, portare la colonna SEC e PBS a temperatura ambiente, quindi stabilizzare la colonna in posizione verticale utilizzando un supporto e un supporto da laboratorio standard. Prima di collegarlo alla colonna SEC, idratare il serbatoio del campione consentendo a cinque millilitri di PBS di fluire attraverso la fritta in un contenitore per rifiuti.
Quindi, svitare il tappo di ingresso della colonna per aggiungere due millilitri di PBS al serbatoio del campione e collegare con attenzione il serbatoio alla colonna mentre il PBS gocciola attraverso la fritta. Per l'equilibrio della colonna, aggiungere 47 millilitri di PBS al serbatoio del campione, quindi aprire la parte inferiore della colonna SEC. Quindi, consentire a tutto il buffer di campionamento caricato di fluire attraverso la colonna ed eliminare il flusso continuo.
Dopo aver caricato due millilitri del campione sul serbatoio del campione, lasciare che il campione entri completamente nella colonna e raccolga il flusso attraverso. Aggiungere immediatamente PBS al serbatoio del campione ad un volume di 14,25 millilitri meno il volume del campione per consentire alla soluzione di fluire attraverso la colonna, scartando la quantità uguale al volume vuoto della colonna. Quindi, posizionare un microtubo a basso legame da due millilitri direttamente sotto la colonna SEC per raccogliere il primo flusso o frazione dopo aver permesso a due millilitri di PBS di passare attraverso la colonna.
Continuare ad aggiungere due millilitri di PBS al serbatoio del campione per raccogliere ogni frazione successiva. Conservare le frazioni raccolte a quattro gradi Celsius per la conservazione a breve termine o meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Per i test di sterilità delle frazioni raccolte di EV, inoculare tre millilitri del terreno di coltura con 100 microlitri delle frazioni da utilizzare nei saggi.
Quindi, coltivare il terreno in condizioni ottimali osservando la torbidità per almeno tre giorni. In alternativa, i campioni di frazione possono essere applicati a piastre di agar contenenti il mezzo utilizzato per far crescere i batteri produttori, quindi verificare la formazione di colonie. Successivamente, conservare gli EV trasferendo dal 25 al 50% delle frazioni singole o raggruppate in tubi leganti a basso contenuto proteico a meno 80 gradi Celsius per evitare cicli di congelamento-disgelo.
L'analisi rappresentativa mostra l'eluizione di EV MP1 di Escherichia coli nelle prime frazioni cromatografiche. Le frazioni da uno a sei contenevano il maggior numero di veicoli elettrici, con un diametro medio inferiore a 100 nanometri. Allo stesso tempo, le frazioni successive contenevano proteine prive di EV e pochissime EV.
L'arricchimento e le dimensioni dell'EV sono stati confermati dalla microscopia elettronica a trasmissione, in particolare nelle frazioni da due a sei. È stato osservato che le frazioni arricchite di EV da due a sette avevano un'elevata attività della nanoluciferasi, ma solo un segnale fluorescente molto basso da mCherry non associato a EV rispetto a quello delle frazioni successive. L'etichettatura immunogold ha confermato l'associazione EV della nanoluciferasi nelle frazioni da due a cinque.
L'applicabilità del protocollo alle altre specie batteriche è stata valutata isolando le EV dalle colture di diversi batteri anaerobici. È stato osservato che le prime frazioni cromatografiche da uno a quattro erano arricchite per EV, con una dimensione del diametro inferiore a 100 nanometri. La complessa infusione cervello-cuore, o BHI, conteneva le particelle delle dimensioni di EV a meno del 25% della resa totale di EV.
È importante utilizzare dispositivi TFF in grado di gestire il volume iniziale della coltura cellulare batterica. Questa tecnica ci consente di generare abbastanza EV per porre domande biologiche sulla loro funzione in modelli animali complessi.
