Bu protokol önemlidir, çünkü hücre dışı vezikülleri çeşitli bakterilerden yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde izole etmenin bir yolunu sağlar. Bu teknikle ilgili en güzel şey, EV'leri in vivo çalışmalara olanak sağlayacak oldukça geniş bakteri kültürü ortamlarından izole etmek için kullanılabilmesidir. Gösterdiğimiz veriler klinik öncesi uygulamaları yansıtırken, bu protokolün terapötikler için bakteriyel EV'lerin üretimine uyarlanabileceği öngörülebilir.
Bu yöntem, küçük değişikliklerle herhangi bir ölçeklenebilir hücre kültürü sistemine uygulanabilir. Protokol ölçeklenebilirliği nedeniyle, bakteri hücre kültürünün istenen başlangıç hacimlerini işlemek için uygun boyutta filtrelere ve SEC sütunlarına sahip olmak önemlidir. Prosedürleri gösterenler, Dr. Justin Lathia'nın laboratuvarında yardımcı teknoloji uzmanı olan Sadie Johnson, Dr. Justin Lathia'nın laboratuvarında onkoloji araştırmacısı olan Dionysius Watson ve laboratuvarımda bir araştırma teknolojisi uzmanı olan Akeem Santos.
Tek bir Escherichia coli kolonisini, steril bir döngü kullanarak 250 ila 1000 mililitre Luria-Bertani veya LB suyuna aşılayarak başlayın. Daha sonra, kültürü dakikada 300 rotasyonda ve 37 santigrat derecede titreyen bir inkübatörde aerobik olarak inkübe edin. 48 saatlik inkübasyondan sonra, 500 mililitrelik polipropilen santrifüj şişelerini temizlemek için hücre kültürlerini 15 dakika boyunca dört santigrat derece ve 5.000 kez G'de büyük kapasiteli, sabit açılı bir rotorda santrifüje aktararak bakteri kültürü ortamını netleştirin.
Süpernatantı temiz santrifüj şişelerine 15 dakika boyunca 10.000 kez G'de dikkatlice dökerek aktarın. Daha sonra, süpernatantı uygun boyutta 0,2 mikronluk bir polietersülfon vakum tahrikli filtre cihazına aktarın ve filtreleme cihazını bir vakum duvarı beslemesine bağlayın. Filtreleme hızı önemli ölçüde düşerse, filtrelenmemiş malzemeyi yeni bir cihaza taşıyın.
Filtrelenmiş ortam gece boyunca dört santigrat derecede saklanabilir veya hemen işlenebilir. Canlı hücrelerin tamamen çıkarılmasını kontrol etmek için, filtrelenmiş süpernatantın bir alikotunu uygun agar plakalarına yayın ve bakteri suşu için optimum koşullarda inkübasyondan sonra herhangi bir koloninin bulunmamasını sağlayın. Filtrelenmiş ortamı 100 mililitre hacimle yoğunlaştırmak için, 90 mililitre filtrelenmiş kültür ortamını santrifüjlü ultrafiltrasyon cihazının rezervuarına 100 kilodalton moleküler ağırlıklı bir kesimle yükleyin ve üst rezervuardaki hacim 0,5 mililitreden daha az yoğunlaşana kadar 15 ila 30 dakikalık aralıklarla sallanan kova rotorunda ortamı dört santigrat derece ve 2.000 kez G'de santrifüj edin.
Rezervuarı kalan filtrelenmiş kültür ortamıyla doldurmak için, yeniden dengelemek üzere cihazın altındaki akışı kaldırın. Rezervuardaki konsantre ortamın viskozitesi gözle görülür şekilde artarsa, ortamı PBS ile seyreltin ve 100 kilodaltonluk moleküler ağırlık kesiminden daha küçük olan hücre dışı vezikülleri veya EV proteinlerini azaltmak için santrifüjleme yoluyla yeniden konsantre edin. Daha sonra, konsantre ortamı gece boyunca dört santigrat derecede saklamak için düşük proteinli bir bağlama tüpüne aktarın Filtrelenmiş ortamı 100 mililitreden daha büyük bir hacimle yoğunlaştırmak için, 100 kilodaltonluk bir moleküler ağırlık kesimine sahip uygun boyutta bir teğetsel akış filtrasyonu veya TFF cihazı seçin.
Makalede açıklandığı gibi bir filtreleme devresini monte ettikten sonra, istenen akış hızına karşılık gelen uygun hızı belirlemek için 200 mililitre PBS'yi dereceli bir kaba pompalayın. Hız ayarlandığında, filtrelenmiş şartlandırılmış ortamı oda sıcaklığında dakikada yaklaşık 200 mililitrede dolaştırın ve 100 kilodaltondan küçük molekülleri toplayın, ultrafiltrasyon membranını ayrı bir kapta atık olarak geçerek şartlandırılmış ortamın hacmi 100 ila 200 mililitreye düşürülene kadar. Filtrelenmiş hacmi PBS ile sırayla iki kat seyreltin ve hacmi 75 ila 100 mililitreye ve daha sonra 25 mililitre ve 10 mililitreye konsantre etmek için ortamı pompayla daha küçük kaplarda dolaştırmaya devam edin.
Besleme borusunu numune haznesinden çıkarın ve maksimum numune miktarını geri kazanmak üzere filtreyi boşaltmak için pompalayın. Konsantre numuneyi, 100 kilodaltonluk moleküler ağırlık kesimine sahip 15 mililitrelik bir santrifüj ultrafiltrasyon cihazına taşıyın ve üst rezervuardaki ortamın hacmi iki mililitreden az olana kadar 15 ila 30 dakikalık aralıklarla dört santigrat derece ve 2.000 kez G'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj yapın. Konsantre ortamı, gece boyunca dört santigrat derecede saklamak için düşük proteinli bir bağlayıcı tüpe aktarın.
EV'lerin izolasyonu için, 100 mililitreden az başlangıç malzemesi için 10 mililitrelik yatak hacmine sahip küçük bir sütun ve 100 mililitreden fazla başlangıç malzemesi için 47 mililitrelik yatak hacmine sahip daha büyük bir sütun kullanarak boyut hariç tutma kromatografisi veya SEC gerçekleştirin. Deneyden birkaç saat önce, SEC kolonunu ve PBS'yi oda sıcaklığına getirin, ardından standart bir laboratuvar standı ve tutucu kullanarak sütunu dikey konumda stabilize edin. SEC kolonuna bağlanmadan önce, beş mililitre PBS'nin fritten bir atık kabına akmasına izin vererek numune haznesini nemlendirin.
Ardından, numune haznesine iki mililitre PBS eklemek için kolonun giriş kapağını sökün ve PBS fritten damlarken rezervuarı dikkatlice kolona bağlayın. Kolonun dengelenmesi için, numune haznesine 47 mililitre PBS ekleyin, ardından SEC sütununun alt kısmını açın. Ardından, yüklenen tüm numune arabelleğinin sütundan akmasına izin verin ve akışı atın.
Numunenin iki mililitresini numune rezervuarına yükledikten sonra, numunenin kolona tamamen girmesine izin verin ve akışı toplayın. PBS'yi derhal numune rezervuarına 14,25 mililitre eksi numune hacminde ekleyin, böylece çözeltinin kolondan akmasına izin verirken, kolon boşluk hacmine eşit miktarı atın. Daha sonra, iki mililitre PBS'nin sütundan geçmesine izin verdikten sonra ilk akışı veya fraksiyonu toplamak için iki mililitrelik düşük bağlayıcı bir mikrotüpü doğrudan SEC sütununun altına yerleştirin.
Sonraki her fraksiyonu toplamak için numune rezervuarına iki mililitre PBS eklemeye devam edin. Toplanan fraksiyonları kısa süreli depolama için dört santigrat derecede veya uzun süreli depolama için eksi 80 santigrat derecede saklayın. EV'lerin toplanan fraksiyonlarının sterilite testi için, kültür ortamının üç mililitresini, tahlillerde kullanılacak fraksiyonların 100 mikrolitresi ile aşılayın.
Daha sonra, en az üç gün boyunca bulanıklığı gözlemlerken ortamı en uygun koşullar altında kültürleyin. Alternatif olarak, fraksiyon örnekleri, üreten bakterileri büyütmek için kullanılan ortamı içeren agar plakalarına uygulanabilir, daha sonra koloni oluşumunu kontrol edebilir. Daha sonra, donma-çözülme döngülerini önlemek için bireysel veya havuzlanmış fraksiyonların% 25 ila% 50'sini eksi 80 santigrat derecede düşük proteinli bağlayıcı tüplere aktararak EV'leri saklayın.
Temsili analiz, erken kromatografi fraksiyonlarında Escherichia coli MP1 EV'lerin elüsyonunu göstermektedir. Bir ila altı fraksiyon, ortalama çapı 100 nanometreden düşük olan en fazla EV'yi içeriyordu. Aynı zamanda, sonraki fraksiyonlar EV-içermeyen proteinler ve çok az sayıda EV içeriyordu.
EV zenginleştirmesi ve boyutu, özellikle iki ila altı fraksiyonda, iletim elektron mikroskobu ile doğrulandı. İki ila yedi EV-ile zenginleştirilmiş fraksiyonların yüksek nanolusiferaz aktivitesine sahip olduğu, ancak daha sonraki fraksiyonlarınkine kıyasla EV ile ilişkili olmayan mCherry'den sadece çok düşük bir floresan sinyaline sahip olduğu gözlenmiştir. İmmünogold etiketleme, nanolusiferazın EV ilişkisini iki ila beş fraksiyonda doğruladı.
Protokolün diğer bakteri türlerine uygulanabilirliği, EV'lerin çeşitli anaerobik bakteri kültürlerinden izole edilmesiyle değerlendirildi. Bir ila dört arasındaki erken kromatografi fraksiyonlarının, çap boyutu 100 nanometreden daha düşük olan EV'ler için zenginleştirildiği gözlendi. Kompleks beyin-kalp infüzyonu veya BHI, toplam EV veriminin% 25'inden daha azında EV boyutlu parçacıkları içeriyordu.
Bakteriyel hücre kültürünün başlangıç hacmini işleyebilen TFF cihazlarının kullanılması önemlidir. Bu teknik, karmaşık hayvan modellerindeki işlevleri hakkında biyolojik sorular sormak için yeterli EV üretmemizi sağlar.
