هذا البروتوكول مهم لأنه يوفر طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلية من مجموعة متنوعة من البكتيريا بطريقة قابلة للتكاثر بدرجة كبيرة. إن الشيء العظيم في هذه التقنية هو أنه يمكن استخدامها لعزل المركبات الكهربائية من بيئات كبيرة جدا من الثقافات البكتيرية ، مما سيمكن من إجراء دراسات في الجسم الحي. في حين أن البيانات التي نعرضها تعكس التطبيقات قبل السريرية ، فمن المتوقع أن يتم تكييف هذا البروتوكول لتصنيع المركبات الكهربائية البكتيرية للعلاجات.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام زراعة خلايا قابل للتطوير مع تعديل طفيف. نظرا لقابلية تطوير البروتوكول ، من المهم أن يكون لديك مرشحات ذات حجم مناسب وأعمدة SEC للتعامل مع أحجام البدء المطلوبة لثقافة الخلايا البكتيرية. يوضح الإجراءات سادي جونسون ، مساعد تقني في مختبر الدكتور جاستن لاثيا ، ديونيسيوس واتسون ، زميل الأورام في مختبر الدكتور جاستن لاثيا ، وأكيم سانتوس ، تقني أبحاث في مختبري.
ابدأ بتلقيح مستعمرات مفردة من الإشريكية القولونية إلى 250 إلى 1000 ملليلتر من مرق لوريا بيرتاني ، أو مرق LB ، باستخدام حلقة معقمة. بعد ذلك ، احتضان الثقافة هوائيا في حاضنة تهتز بمعدل 300 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة من الحضانة ، قم بتوضيح وسط الاستزراع البكتيري عن طريق نقل مزارع الخلايا لتنظيف زجاجات الطرد المركزي المصنوعة من مادة البولي بروبيلين سعة 500 مل إلى أجهزة الطرد المركزي في دوار كبير السعة وثابت الزاوية عند أربع درجات مئوية و 5000 مرة G لمدة 15 دقيقة.
نقل الطافي لتنظيف زجاجات الطرد المركزي عن طريق صب بعناية إلى أجهزة الطرد المركزي في 10،000 مرة G لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بنقل المادة الطافية إلى جهاز مرشح يعمل بالفراغ من البولي إيثر سلفون بحجم مناسب وقم بتوصيل جهاز الترشيح بمصدر جدار مفرغ. إذا انخفض معدل الترشيح بشكل كبير ، فانقل المادة غير المفلترة إلى جهاز جديد.
يمكن تخزين الوسيط المصفى عند أربع درجات مئوية طوال الليل أو يمكن معالجته على الفور. للتحقق من الإزالة الكاملة للخلايا القابلة للحياة ، قم بنشر حصص من المادة الطافية المفلترة على ألواح أجار مناسبة وتأكد من عدم وجود أي مستعمرات بعد الحضانة في الظروف المثلى للسلالة البكتيرية. لتركيز الوسط المصفى بحجم 100 ملليلتر، قم بتحميل 90 ملليلتر من وسط الاستزراع المرشح على خزان جهاز الترشيح الفائق بالطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 100 كيلو دالتون وجهاز الطرد المركزي في دوار دلو متأرجح عند أربع درجات مئوية و 2000 مرة G لفترات 15 إلى 30 دقيقة حتى يتركز حجم الخزان العلوي إلى أقل من 0.5 ملليلتر.
لتعبئة الخزان بأي وسيط استزراع مفلتر متبقي، قم بإزالة التدفق في الجزء السفلي من الجهاز لإعادة التوازن. إذا زادت لزوجة الوسط المركز في الخزان بشكل واضح ، قم بتخفيف الوسط باستخدام PBS وأعد التركيز عن طريق الطرد المركزي لتقليل أي حويصلة غير خارج الخلية ، أو بروتينات EV ، أصغر من قطع الوزن الجزيئي البالغ 100 كيلو دالتون. بعد ذلك ، انقل الوسط المركز إلى أنبوب ربط منخفض البروتين لتخزينه عند أربع درجات مئوية طوال الليل لتركيز الوسط المصفى بحجم أكبر من 100 ملليلتر ، حدد ترشيح التدفق العرضي بحجم مناسب ، أو جهاز TFF ، مع قطع الوزن الجزيئي 100 كيلو دالتون.
بعد تجميع دائرة ترشيح كما هو موضح في المخطوطة ، قم بضخ 200 ملليلتر من PBS في وعاء مدرج لتحديد السرعة المناسبة المقابلة لمعدل التدفق المطلوب. عند ضبط السرعة ، قم بتدوير الوسط المكيف المصفى بحوالي 200 ملليلتر في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة وجمع الجزيئات الأصغر من 100 كيلو دالتون ، وعبور غشاء الترشيح الفائق كنفايات في وعاء منفصل حتى يتم تقليل حجم الوسط المكيف إلى 100 إلى 200 ملليلتر. قم بتخفيف الحجم المصفى بالتتابع مرتين باستخدام PBS واستمر في تدوير الوسط مع المضخة في أوعية أصغر لتركيز الحجم على 75 إلى 100 ملليلتر ، ثم إلى 25 ملليلتر و 10 ملليلتر.
ارفع أنبوب التغذية من خزان العينة وضخ لتطهير المرشح لاستعادة أكبر قدر ممكن من العينة. انقل العينة المركزة إلى جهاز ترشيح فائق بالطرد المركزي سعة 15 ملليلتر مع قطع الوزن الجزيئي بمقدار 100 كيلو دالتون وأجهزة طرد مركزي في دوار دلو متأرجح عند أربع درجات مئوية و 2،000 مرة G لفترات تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة حتى يصبح حجم الوسط في الخزان العلوي أقل من ملليلتر. انقل الوسط المركز إلى أنبوب ربط منخفض البروتين لتخزينه عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
لعزل المركبات الكهربائية ، قم بإجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، أو SEC ، باستخدام عمود صغير بحجم سرير 10 ملليلتر لأقل من 100 ملليلتر من مواد البدء وعمود أكبر بحجم سرير 47 ملليلتر لأكثر من 100 ملليلتر من مواد البدء. على مدى عدة ساعات قبل التجربة ، أحضر عمود SEC و PBS إلى درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بتثبيت العمود في وضع رأسي باستخدام حامل وحامل مختبر قياسي. قبل الاتصال بعمود SEC ، قم بترطيب خزان العينة عن طريق السماح لخمسة ملليلتر من PBS بالتدفق عبر الفريت إلى حاوية نفايات.
بعد ذلك ، قم بفك غطاء مدخل العمود لإضافة ملليلتر من PBS إلى خزان العينة وقم بتوصيل الخزان بالعمود بعناية أثناء تساقط PBS من خلال الفريت. لموازنة العمود ، أضف 47 ملليلترا من PBS إلى خزان العينة ، متبوعا بإلغاء تغطية الجزء السفلي من عمود SEC. بعد ذلك، اسمح لكل المخزن المؤقت للعينة المحملة بالتدفق عبر العمود وتجاهل التدفق من خلاله.
بعد تحميل ملليلتر من العينة على خزان العينة، اسمح للعينة بدخول العمود بالكامل وجمع التدفق. أضف PBS على الفور إلى خزان العينة بحجم 14.25 ملليلتر مطروحا منه حجم العينة للسماح للمحلول بالتدفق عبر العمود ، مع تجاهل الكمية التي تساوي حجم فراغ العمود. بعد ذلك ، ضع أنبوبا صغيرا منخفض الربط بسعة 2 ملليلتر أسفل عمود SEC مباشرة لجمع التدفق الأول أو الكسر الأول بعد السماح لملليلتر من PBS بالمرور عبر العمود.
استمر في إضافة مليلتر من PBS إلى خزان العينة لجمع كل جزء لاحق. قم بتخزين الكسور المجمعة عند أربع درجات مئوية للتخزين على المدى القصير أو 80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. لاختبار العقم للأجزاء المجمعة من المركبات الكهربائية ، قم بتلقيح ثلاثة ملليلتر من وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من الكسور لاستخدامها في المقايسات.
بعد ذلك ، قم بزراعة الوسط في ظل الظروف المثلى مع مراقبة التعكر لمدة ثلاثة أيام على الأقل. بدلا من ذلك ، يمكن تطبيق عينات الكسور على ألواح أجار تحتوي على الوسط المستخدم لزراعة البكتيريا المنتجة ، ثم التحقق من تكوين مستعمرة. بعد ذلك ، قم بتخزين المركبات الكهربائية عن طريق نقل 25 إلى 50٪ من الكسور الفردية أو المجمعة إلى أنابيب ربط منخفضة البروتين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتجنب دورات التجميد والذوبان.
يظهر التحليل التمثيلي شطف الإشريكية القولونية MP1 EVs في كسور الكروماتوغرافيا المبكرة. احتوت الكسور من واحد إلى ستة على معظم المركبات الكهربائية ، بمتوسط قطر أقل من 100 نانومتر. في الوقت نفسه ، احتوت الكسور اللاحقة على بروتينات خالية من EV وعدد قليل جدا من EVs.
تم تأكيد تخصيب EV وحجمه بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ ، خاصة في الكسور من الثاني إلى السادس. لوحظ أن الكسور المخصبة ب EV من اثنين إلى سبعة لها نشاط نانولوسيفيراز مرتفع ، ولكن فقط إشارة فلورية منخفضة جدا من mCherry غير المرتبطة ب EV مقارنة بتلك الموجودة في الأجزاء اللاحقة. أكدت علامة immunogold ارتباط EV ل nanoluciferase في الكسور من اثنين إلى خمسة.
تم تقييم قابلية تطبيق البروتوكول على الأنواع البكتيرية الأخرى عن طريق عزل EVs من مزارع البكتيريا اللاهوائية المتنوعة. لوحظ أن الكسور اللونية المبكرة من واحد إلى أربعة تم إثراؤها للمركبات الكهربائية ، بحجم قطر أقل من 100 نانومتر. احتوى التسريب المعقد للدماغ والقلب ، أو BHI ، على جزيئات بحجم EV بأقل من 25٪ من إجمالي عائد EV.
من المهم استخدام أجهزة TFF القادرة على التعامل مع حجم البداية لثقافة الخلايا البكتيرية. تسمح لنا هذه التقنية بتوليد ما يكفي من المركبات الكهربائية لطرح أسئلة بيولوجية حول وظيفتها في النماذج الحيوانية المعقدة.
