许多母系表达基因在早期发育中的作用目前尚不清楚。这种母体CRISPR技术允许快速鉴定母体效应基因及其在发育中的作用。将RNA复用引导到单个基因，使研究人员能够在一代中鉴定出新的母体效应表型。
这项研究有利于了解配子中mRNA转录物的功能，这是早期胚胎发生所必需的。该技术的关键是在单细胞阶段早期对胚胎进行微注射，并检查大多数引导RNA是否可以在注射的胚胎中产生体细胞突变。要为每个基因特异性寡核苷酸创建向导RNA模板，请分析恒定寡核苷酸并用T4 DNA聚合酶填充突出部分。
组装四个引导RNA模板后，使用DNA净化和浓缩试剂盒将它们纯化并浓缩在一起。使用体外 T7 转录试剂盒从混合的 guy RNA 模板合成 sgRNA 混合物，并按照手稿中所述进行体外转录。为了验证sgRNA的完整性，灌制1%琼脂糖每毫升0.5微克溴化乙锭三硼酸盐-EDTA凝胶。
将固化凝胶置于三硼酸盐-EDTA电泳缓冲液中。混合一微升sgRNA混合物和一微升RNA凝胶上样缓冲液。将此样品加载到凝胶中，并在100伏下运行凝胶5分钟。
使用紫外线可视化条带。设置野生型杂交和斑马鱼交配箱。将雄鱼和雌鱼放在同一个水箱中，但使用交配箱分隔器将它们分开，或者如图所示，将雌鱼放在产卵插入物中。
注射鸡尾酒组装完成后，通过移除交配箱分隔器或如图所示，通过将雄性放入与雌性相同的产卵插入物中，让雄性和雌配。为了同步胚胎，在10分钟后使用塑料过滤器收集它们，并使用1XE3培养基将它们冲洗到培养皿中。取出10至15个胚胎，并将它们放入单独的培养皿中，作为未注射的对照保存。
将剩余的胚胎转移到注射板孔中。将一纳升蛋白质sgRNA溶液注入单细胞胚胎的发育胚泡盘中。使用镊子折断堵塞的针尖并重新校准针头以弹出一纳升的推注。
注射后的第二天，从未注射的平板中收集六个健康注射胚胎和两个对照胚胎。将每个胚胎单独放入PCR试管的单个孔中，并标记试管的顶部。为每个引导位点设计独特的筛选引物，以扩增包含CRISPR-Cas9靶位点的100至110个碱基配对DNA片段。
如果可能，将靶位点放在扩增片段的中间，以便识别较大的缺失。对于四个引导靶位点中的每一个，使用5微升制备的单胚胎基因组DNA和20微升PCR混合物设置8个25微升PCR反应，并指导特异性筛选引物混合物，以鉴定靶位点中的体细胞突变。使用形成约0.625厘米宽孔的梳子浇铸2.5%琼脂糖，每毫升0.5微克溴化乙锭三硼酸盐-EDTA凝胶。
然后将固化的凝胶放入含有三硼酸盐-EDTA电泳缓冲液的电泳室中。向PCR产物中加入5微升6X上样染料。将25微升该混合物加载到凝胶中，确保进样样品和对照样品在同一凝胶行上运行。
加载所有样品后，每一升三硼酸盐-EDTA电泳缓冲液向凝胶盒的正端加入5微升溴化乙锭。以 120 伏电泳凝胶，直到 DNA 禁令消退或 DNA 接近泳道终点。为了鉴定母体效应表型和母体CRISPR的胚胎，在实验前的下午设置F0注射雌性与野生型雄性，并在标准斑马鱼交配箱中控制野生型杂交。
将雄鱼和雌鱼放在同一个水箱中，但用交配箱分隔器将它们分开，或将雌鱼放在产卵插入物中。在实验的早晨，通过移除交配箱分隔器或将雄性放在与雌性相同的产卵插入物中，让雄性和雌性开始交配。通过将产卵插入物移动到包含新鲜系统水的新交配水箱底部，每 10 分钟收集一次胚胎，并用标识单个 F0 雌性的标签标记水箱。
取旧的交配罐，将水倒入T型过滤器，从一个单独的10分钟离合器中收集胚胎。在带有超然光源的解剖显微镜下，每小时观察一次发育的胚胎，前六到八个小时，接下来的五天每天观察一次。将潜在的母体CRISPR胚胎移至含有1XE3培养基的培养皿中，并在受精后24小时测定形态表型，并在受精后5天测定活力。
在实验前的下午，通过将野生型雄性与雌性物理分开，使用交配箱分隔器或将雌性放入产卵插入物中，设置F0雌性的交配对。在实验的早晨，移除物理隔板以启动交配。在产卵的第一个迹象时，通过将雄性和F0雌性分开来中断繁殖，并将每个分离的F0雌性保存在单独的交配箱中。
体外受精后，让单倍体胚胎发育，直到观察到母体CRISPR表型，并将这些胚胎放入不同的培养皿中。一旦鉴定出母体CRISPR单倍体胚胎，让它们在受精后发育至少六个小时。为了从至少10个母体CRISPR单倍体胚胎中提取基因组DNA，将单个单倍体胚胎放入PCR试管的单个孔中，从孔中去除多余的E3培养基，并加入50微升50毫摩尔氢氧化钠。
将胚胎在95摄氏度下孵育20分钟，然后冷却至4摄氏度。然后加入五微升一摩尔三盐酸，pH 7.5，涡旋5至10秒。为了确定哪些引导位点含有插入缺失，请设计测序引物来扩增包括所有四个CRISPR / Cas9靶位点的DNA片段。
使用5微升制备的基因组DNA和测序引物，为每个胚胎设置两个25微升的PCR反应。PCR完成后，使用DNA净化和浓缩试剂盒纯化和浓缩两个样品，并使用正向和反向测序引物将DNA片段提交给Sanger测序。在母体CRISPR的产生过程中，引导RNA之间应该全部聚集在一起，向导RNA之间几乎没有重叠区域。
如果产生了插入缺失，则应在琼脂糖凝胶上的注射样品中观察到涂片，但在未注射的对照中则不观察到涂片。母体CRISPR方法可用于表型复制已知的母体效应突变，例如杂色，TMI和aura。为了鉴定导致母体CRISPR表型的遗传病变，紫外线处理的精子和体外受精相结合，以产生母体CRISPR单倍体。
单倍体的创建允许对母体等位基因进行Sanger测序，并鉴定母体CRISPR插入缺失。在识别非母体效应表型时，您必须能够在多个 F0 女性中观察到它，因为它增加了表型是由功能丧失引起的几率，而不是脱靶或非特异性效应。在确定母体效应表型后，母体CRISPR胚胎可用于检查对早期胚胎发生的各个方面的影响，例如鼻窦骨架或DNA分离。
这使研究人员能够了解表型的分子原因。这种方法直接测试了单代未知母系表达基因的功能，加快了我们对早期胚胎发生过程中作用的过程的理解。
