Il ruolo di molti geni espressi per la madre durante lo sviluppo precoce è attualmente sconosciuto. Questa tecnica CRISPR materna consente la rapida identificazione dei geni dell'effetto materno e del loro ruolo nello sviluppo. Il multiplexing guida gli RNA a un singolo gene, consente ai ricercatori di identificare nuovi fenotipi di effetti materni in una singola generazione.
Questa ricerca è utile per comprendere la funzione dei trascritti di mRNA nei gameti, che sono necessari per l'embriogenesi precoce. La chiave di questa tecnica è quella di microiniettare gli embrioni all'inizio della fase di una cellula e controllare che la maggior parte degli RNA guida possa fare mutazioni somatiche negli embrioni iniettati. Per creare un modello di RNA guida per ogni oligonucleotide specifico del gene, analizzare l'oligonucleotide costante e riempire le sporgenze con T4 DNA polimerasi.
Dopo aver assemblato i quattro modelli di RNA guida, purificarli e concentrarli insieme utilizzando un kit di pulizia e concentrazione del DNA. Sintetizzare la miscela di sgRNA dal modello di RNA di guy raggruppato, utilizzando un kit di trascrizione T7 in vitro ed eseguire la trascrizione in vitro come descritto nel manoscritto. Per verificare l'integrità dello sgRNA, gettare un 1% agarosio 0,5 microgrammi per millilitro, bromuro di etidio Tris-Borate-EDTA gel.
Posizionare il gel solidificato nel tampone di esecuzione Tris-Borate-EDTA. Mescolare una miscela di sgRNA da microlitri e un tampone di carico gel di RNA da microlitro. Caricare questo campione nel gel e far funzionare il gel a 100 volt per cinque minuti.
Visualizza le bande usando la luce ultravioletta. Imposta croci di tipo selvatico e scatole di accoppiamento zebrafish. Tenere il pesce maschio e femmina nella stessa vasca, ma separarli usando un divisorio di accoppiamento, o come mostrato qui, posizionando la femmina all'interno di un inserto di deposizione delle uova.
Dopo aver assemblato il cocktail di iniezione, consentire al maschio e alla femmina di accoppiarsi rimuovendo il divisore della scatola di accoppiamento o, come mostrato qui, posizionando il maschio nello stesso inserto di deposizione delle uova della femmina. Per sincronizzare gli embrioni, raccoglierli dopo 10 minuti usando un colino di plastica e sciacquarli in una capsula di Petri usando il supporto 1XE3. Rimuovere da 10 a 15 embrioni e metterli in una capsula di Petri separata per essere conservati come controlli non iniettati.
Trasferire gli embrioni rimanenti nei pozzetti della piastra di iniezione. Iniettare una soluzione di sgRNA proteico da nanolitri, nel disco blasto in via di sviluppo di un embrione monocellulare. Utilizzare una pinza per rompere la punta dell'ago ostruito e ricalibrare l'ago per espellere un bolo da un nanolitro.
Il giorno successivo all'iniezione, raccogliere sei embrioni sani iniettati e due embrioni di controllo dalla piastra non iniettata. Posizionare ogni embrione individualmente in un singolo pozzetto di un tubo di striscia PCR ed etichettare la parte superiore dei tubi. Progetta primer di screening unici per ogni sito guida per amplificare un frammento di DNA accoppiato da 100 a 110 basi che include il sito target CRISPR-Cas9.
Se possibile, posizionare il sito di destinazione al centro del frammento amplificato, consentendo l'identificazione di delezioni più grandi. Per ciascuno dei quattro siti bersaglio guida, impostare otto reazioni PCR da 25 microlitri utilizzando cinque microlitri del DNA embriogenomico singolo preparato e 20 microlitri della miscela PCR e guidare la miscela di primer di screening specifici, per identificare mutazioni somatiche nel sito bersaglio. Gettare un 2,5% agarosio, 0,5 microgrammi per millilitro di bromuro di etidio Tris-Borate-EDTA gel utilizzando pettini che creano pozzetti larghi circa 0,625 centimetri.
Quindi posizionare il gel solidificato nella camera di elettroforesi contenente il tampone di corsa Tris-Borate-EDTA. Aggiungere cinque microlitri di colorante di carico 6X al prodotto PCR. Caricare 25 microlitri di questa miscela nel gel, assicurandosi che i campioni iniettati e di controllo siano in esecuzione sulla stessa fila di gel.
Dopo aver caricato tutti i campioni, aggiungere cinque microlitri di bromuro di etidio per un litro di tampone Tris-Borate-EDTA, all'estremità positiva della scatola di gel. Eseguire il gel a 120 volt fino a quando i divieti del DNA si risolvono o il DNA si avvicina alla fine della corsia. Per identificare i fenotipi dell'effetto materno e gli embrioni materni di CRISPR, impostare le femmine iniettate F0 contro maschi wild type e controllare gli incroci di tipo selvatico in scatole standard di accoppiamento di pesci zebra durante il pomeriggio prima dell'esperimento.
Metti il pesce maschio e femmina nello stesso acquario, ma separali con un divisorio per la scatola di accoppiamento o posiziona la femmina all'interno di un inserto per la deposizione delle uova. La mattina dell'esperimento, consentire al maschio e alla femmina di iniziare l'accoppiamento rimuovendo il divisorio della scatola di accoppiamento o posizionando il maschio nello stesso inserto di deposizione delle uova della femmina. Raccogliere gli embrioni ogni 10 minuti spostando l'inserto di deposizione delle uova in un nuovo fondo della vasca di accoppiamento che contiene acqua fresca del sistema ed etichettare la vasca con un'etichetta che identifica la singola femmina F0.
Prendi la vecchia vasca di accoppiamento e versa l'acqua attraverso un colino a T per raccogliere gli embrioni da una frizione individuale di 10 minuti. Sotto un microscopio da dissezione con una fonte di luce trascendente, osservare gli embrioni in fase di sviluppo ogni ora, per le prime sei-otto ore, e ogni giorno per i successivi cinque giorni. Spostare i potenziali embrioni materni CRISPR in una capsula di Petri che contiene 1XE3 media e analizzare il fenotipo morfologico a 24 ore dopo la fecondazione e la vitalità, a cinque giorni dopo la fecondazione.
Il pomeriggio prima dell'esperimento, impostare coppie di accoppiamento di femmine F0 mantenendo i maschi di tipo selvatico fisicamente separati dalle femmine, usando un divisore di scatola di accoppiamento o posizionando la femmina nell'inserto di deposizione delle uova. La mattina dell'esperimento, rimuovere la partizione fisica per avviare l'accoppiamento. Al primo segno di deposizione delle uova, interrompere l'allevamento separando il maschio e le femmine F0 e mantenere ogni femmina F0 separata in singole scatole di accoppiamento.
Dopo la fecondazione in vitro, lasciare che gli embrioni aploidi si sviluppino fino a quando non si osserva il fenotipo materno CRISPR e posizionare tali embrioni in una capsula di Petri diversa. Una volta identificati gli embrioni aploidi materni CRISPR, lasciarli sviluppare per almeno sei ore dopo la fecondazione. Per estrarre il DNA genomico da almeno 10 embrioni aploidi materni CRISPR, posizionare un singolo embrione aploide in un singolo pozzetto di un tubo a striscia PCR, rimuovere i mezzi E3 in eccesso dal pozzetto e aggiungere 50 microlitri di idrossido di sodio 50 millimolare.
Incubare gli embrioni per 20 minuti a 95 gradi Celsius e raffreddarli a quattro gradi Celsius. Quindi aggiungere cinque microlitri di acido tris-cloridrico monolare con pH 7,5 e vortice per cinque a 10 secondi. Per identificare quali siti guida contengono indel, progettare primer di sequenziamento per amplificare un frammento di DNA che includa tutti e quattro i siti bersaglio CRISPR / Cas9.
Impostare due 25 microlitri di reazioni PCR per embrione, utilizzando cinque microlitri del DNA genomico preparato e i primer di sequenziamento. Al termine della PCR, purificare e concentrare i due campioni utilizzando un kit di pulizia e concentrazione del DNA e sottoporre il frammento di DNA al sequenziamento Sanger, utilizzando i primer di sequenziamento avanti e indietro. Gli RNA guida dovrebbero essere tutti raggruppati insieme con regioni minime o nulle sovrapposte tra gli RNA guida durante la generazione materna di CRISPR.
Se sono stati creati indel, uno striscio deve essere osservato nei campioni iniettati su un gel di agarosio, ma non nel controllo non iniettato. Il metodo CRISPR materno può essere utilizzato per fenocopiare mutazioni note dell'effetto materno, come motley, tmi e aura. Per identificare le lesioni genetiche che contribuiscono al fenotipo materno CRISPR, gli spermatozoi trattati con UV e la fecondazione in vitro vengono combinati per creare aploidi CRISPR materni.
La creazione di un aploide consente il sequenziamento Sanger dell'allele materno e l'identificazione degli indels CRISPR materni. Quando si identifica un fenotipo di effetto non materno, è essenziale che si sia in grado di osservarlo in più femmine F0, perché aumenta le probabilità che il fenotipo sia causato dalla perdita di funzione, non da effetti fuori bersaglio o non specifici. Dopo che è stato identificato un fenotipo di effetto materno, gli embrioni CRISPR materni possono essere utilizzati per esaminare gli effetti su vari aspetti dell'embriogenesi precoce, come lo scheletro del seno o la segregazione del DNA.
Ciò consente ai ricercatori di comprendere la causa molecolare del fenotipo. Questo metodo testa direttamente la funzione di geni sconosciuti espressi per via materna in una singola generazione, accelerando la nostra comprensione dei processi, agendo durante l'embriogenesi precoce.
