小鼠 体内 胎盘靶向CRISPR操作

该协议意义重大，因为它允许使用CRISPR对小鼠胎盘进行特定时间的靶向操作。这将使研究人员能够阐明怀孕中晚期的特定基因功能。导致小鼠胎盘内过度表达的遗传操作非常罕见。

这种技术的主要优点是它允许胎盘内的一系列基因表达变化。如果初步条款有这种技术不成功，不要气馁。由于这种技术具有挑战性，因此需要相当多的时间来练习才能掌握。

首先，将麻醉的大坝仰卧位与鼻锥一起放置，以在准备区域维持麻醉。彻底剃掉大坝的腹部。为防止角膜干燥，请将人工泪液凝胶放在大坝的双眼上。

然后使用无菌棉尖涂抹器对手术部位进行消毒，至少交替三轮聚维酮碘溶液，然后用70%乙醇和最后一层聚维酮碘溶液进行消毒。准备好后，将带有麻醉鼻锥的大坝移动到指定的手术区域。对于子宫剖腹手术，将大坝仰卧放在手术台上，并用胶带将鼻锥固定到位。

将加热垫放在设置为 45 摄氏度的吸收垫下方。通过无脚趾夹反流确认麻醉深度后，使用镊子和剪刀在帐篷向上的皮肤上做一个大约两厘米的中线切口。然后使用无菌镊子在腹膜上做一个垂直切口，轻轻地远离子宫角。

用手指按压腹部两侧来按摩两个子宫角。将暴露的子宫放在放置在下腹部的无菌手术单上，并根据需要用温热的无菌盐水滴保持湿润。一旦子宫暴露，选择三对胎盘进行操作。

记录胎盘操作的位置和子宫角内胚胎的组织。对于对照质粒的胎盘注射，使用校准的微量移液管加载足够量的适当对照质粒进行三次注射。在蜕膜和交界区之间以大约0.5毫米的深度横向进入胎盘进行所有注射。

注射后但在电穿孔前，用无菌盐水涂覆接触部位，用滴管或注射器将盐水精确地涂抹在子宫壁和桨上的三个部位。在注射后两分钟内，使用连接到电穿孔机的一对三毫米桨进行电穿孔。为确保CRISPR掺入效率和胚胎的活力，请将设置调整为30伏，30毫秒脉冲，两个脉冲，970毫秒脉冲关闭和单极。

轻轻按压胎盘侧面的子宫壁上的电穿孔桨。将阳极桨放在注入部位和正对面的阴极上。按下电穿孔机上的脉冲并等待两个脉冲完成，然后再取出电穿孔拨片。

然后如前所述进行胎盘注射实验质粒。在注射后两分钟内对所有三个实验性注射胎盘进行电穿孔，就像对照组一样。胎盘操作完成后，仅用手指直接操作子宫角，将子宫角轻轻按摩回腹腔内。

使用45厘米长的涂层和编织的可溶解缝合线和13毫米，八分之三的圆形针合金在腹膜层上进行断续缝合。缝合腹膜层后，使用与腹膜相同的可溶解缝合线用可溶解缝合线缝合皮肤。缝合完成后，在皮肤上的缝合线上涂上组织粘合剂。

当组织粘合剂干燥后，关闭蒸发器并将大坝从手术区域转移到其背部的支撑笼中。胎盘注射一般CRISPR Cas9对照质粒和活化对照CRISPR质粒或IGF-1 SAM活化质粒。具有代表性的尸检后图像显示，在任何治疗组中，表型外观均未出现明显损伤或变化。

未处理胚胎在操纵窝中的存活率平均下降至79.05%，而操纵胚胎存活率显着下降，平均为55.56%，任何组的胎盘重量均无显着差异。与假手术相比，手术后产妇体重增加没有显着差异。许多怀孕的母亲在手术后的第二天体重略有下降或没有变化，这可能是由于手术期间和手术后短暂的饮食中断。

大多数大坝在E14.5上显示出重量增加，但偶尔仍然观察到重量减轻。qPCR显示IGF-1过表达胎盘中IGF-1表达与对照胎盘相比显着增加。E14.5胎盘的ELIZA评估显示，与对照胎盘相比，IGF-1过表达胎盘中的IGF-1蛋白水平显着增加。

绿色自发荧光显示胎盘母体胎儿界面的亚区域仅在IGF-1过表达胎盘中具有红色Cas9标记，表明CRISPR成功结合到胎盘的所有三个亚区。C2杂交标记中的荧光证实了IGF-1活化质粒的掺入，没有迁移到未经处理的胎盘中。蜕膜和迷宫区可以识别出由Prl8a8染色标记的红色交界区周围的区域。

记得记录胎盘和相应胚胎的操作类型和位置。强烈建议记录子宫颈和胚胎在子宫角内的位置。按照这个程序，可以对胎盘、胚胎和母亲进行分析。

这将使我们能够更好地了解基因胎盘在怀孕、胎盘功能和胚胎发育中的特异性作用。