Роль многих матерински-экспрессированных генов в раннем развитии в настоящее время неизвестна. Этот метод материнского CRISPR позволяет быстро идентифицировать гены материнского эффекта и их роль в развитии. Мультиплексирование направляет РНК к одному гену, позволяет исследователям идентифицировать новые фенотипы материнского эффекта в одном поколении.
Это исследование полезно для понимания функции транскриптов мРНК в гаметах, которые необходимы для раннего эмбриогенеза. Ключом к этому методу является микроинъекция эмбрионов на ранней стадии одной клетки и проверка, чтобы увидеть, что большинство направляющих РНК могут делать соматические мутации в введенных эмбрионах. Чтобы создать шаблон направляющей РНК для каждого гена специфического олигонуклеотида, проведите анализ постоянного олигонуклеотида и заполните выступы ДНК-полимеразой Т4.
После того, как четыре шаблона направляющей РНК собраны, очистите и сконцентрируйте их вместе, используя комплект для очистки ДНК и концентратора. Синтезируйте смесь sgRNA из объединенного шаблона РНК парня, используя набор транскрипции T7 in vitro, и выполните транскрипцию in vitro, как описано в рукописи. Чтобы проверить целостность сгРНК, отлил 1%агарозу 0,5 мкг на миллилитр, этидий бромид Трис-Борат-ЭДТА гель.
Поместите затвердевший гель в буфер работы Tris-Borate-EDTA. Смешайте одну микролитровую смесь сгРНК и один микролитр РНК-гель нагрузочного буфера. Загрузите этот образец в гель и запустите гель со скоростью 100 вольт в течение пяти минут.
Визуализируйте полосы с помощью ультрафиолетового света. Установите кресты дикого типа и брачные ящики для рыбок данио. Держите самцов и самок рыб в одном аквариуме, но разделяйте их с помощью разделителя брачного ящика или, как показано здесь, помещая самку внутрь вставки для яйцекладки.
После того, как коктейль для инъекций собран, позвольте самцу и самке спариваться, удалив разделитель брачного ящика или, как показано здесь, поместив самца в ту же вставку для яйцекладки, что и самка. Чтобы синхронизировать эмбрионы, соберите их через 10 минут с помощью пластикового ситечка и промойте их в чашку Петри с использованием среды 1XE3. Удалите от 10 до 15 эмбрионов и поместите их в отдельную чашку Петри, которая будет храниться в качестве неинъекционной контрольной группы.
Перенесите оставшиеся эмбрионы в колодцы инъекционной пластины. Введите один раствор нанолитровой белковой сгРНК в развивающийся бластодиск одноклеточного эмбриона. Используйте щипцы, чтобы сломать кончик забитой иглы и повторно откалибровать иглу, чтобы извлечь один нанолитровый болюс.
На следующий день после инъекции соберите шесть здоровых введенных эмбрионов и два контрольных эмбриона из неинъецированной пластины. Поместите каждый эмбрион по отдельности в одну лунку трубки для полоски ПЦР и пометьте верхнюю часть трубок. Разработайте уникальные экранирующие праймеры для каждого направляющего сайта, чтобы усилить от 100 до 110 базовых парных фрагментов ДНК, который включает в себя целевой сайт CRISPR-Cas9.
Если возможно, поместите целевой сайт в середину усиленного фрагмента, что позволит идентифицировать более крупные удаления. Для каждого из четырех направляющих целевых участков настройте восемь 25 микролитровых реакций ПЦР с использованием пяти микролитров подготовленной одной эмбриогеномной ДНК и 20 микролитров смеси ПЦР и направьте конкретную смесь скрининговых праймеров для выявления соматических мутаций в целевом участке. Отлить 2,5% агарозы, 0,5 мкг на миллилитр этидия бромида Трис-Борат-ЭДТА гель с использованием гребней, которые создают скважины шириной около 0,625 сантиметра.
Затем поместите затвердевший гель в камеру электрофореза, содержащую работающий буфер Tris-Borate-EDTA. Добавьте пять микролитров 6-кратного загрузочного красителя в продукт ПЦР. Загрузите 25 микролитров этой смеси в гель, гарантируя, что введенные и контрольные образцы работают на одном гелевом ряду.
После того, как все образцы загружены, добавьте пять микролитров бромида этидия на один литр рабочего буфера Tris-Borate-EDTA к положительному концу гелевой коробки. Запускайте гель со скоростью 120 вольт до тех пор, пока запреты ДНК не разрешатся или ДНК не приблизится к концу полосы. Чтобы определить фенотипы материнского эффекта и материнские эмбрионы CRISPR, настройте F0 введенных самок против самцов дикого типа и контролируйте скрещивания дикого типа в стандартных брачных ящиках для рыб данио во второй половине дня перед экспериментом.
Поместите самца и самку рыб в один аквариум, но разделите их разделителем брачного ящика или поместите самку внутрь вставки для яйцекладки. Утром в ходе эксперимента позвольте самцу и самке начать спаривание, удалив разделитель брачного ящика или поместив самца в ту же яйцекладущую вставку, что и самку. Собирайте эмбрионы каждые 10 минут, перемещая вставку для яйцекладки в новое дно брачного резервуара, содержащее пресную системную воду, и маркируйте резервуар меткой, идентифицирующей особую самку F0.
Возьмите старый брачный бак и налейте воду через Т-ситечко, чтобы собрать эмбрионы из одной индивидуальной 10-минутной кладки. Под рассекающим микроскопом с трансцендентным источником света наблюдайте за эмбрионами, подвергающимися развитию, каждый час, в течение первых шести-восьми часов и ежедневно в течение следующих пяти дней. Переместите потенциальные материнские эмбрионы CRISPR в чашку Петри, содержащую среду 1XE3, и проведите анализ морфологического фенотипа через 24 часа после оплодотворения и жизнеспособности через пять дней после оплодотворения.
Во второй половине дня перед экспериментом настройте спаривание пар самок F0, сохраняя самцов дикого типа физически отделенными от самок, используя разделитель брачного ящика или помещая самку в вставку для яйцекладки. Утром в ходе эксперимента удалите физическую перегородку, чтобы начать спаривание. При первых признаках откладывания яиц прерывайте размножение, разделяя самца и самок F0, и держите каждую разделенную самку F0 в отдельных брачных ящиках.
После экстракорпорального оплодотворения позвольте гаплоидным эмбрионам развиваться до тех пор, пока не будет наблюдаться материнский фенотип CRISPR, и поместите эти эмбрионы в другую чашку Петри. После того, как материнские гаплоидные эмбрионы CRISPR были идентифицированы, позвольте им развиваться в течение не менее шести часов после оплодотворения. Чтобы извлечь геномную ДНК по меньшей мере из 10 материнских гаплоидных эмбрионов CRISPR, поместите один гаплоидный эмбрион в индивидуальную лунку ПЦР-полосной трубки, удалите излишки среды E3 из скважины и добавьте 50 микролитров 50 миллимолярного гидроксида натрия.
Инкубируйте эмбрионы в течение 20 минут при 95 градусах Цельсия и охладите их до четырех градусов Цельсия. Затем добавляют пять микролитров одной молярной трис-соляной кислоты с рН 7,5, и вихрь в течение пяти-10 секунд. Чтобы определить, какие направляющие сайты содержат индели, разработайте секвенирование праймеров для усиления фрагмента ДНК, включая все четыре целевых сайта CRISPR / Cas9.
Настройте два 25 микролитров реакций ПЦР на эмбрион, используя пять микролитров подготовленной геномной ДНК, и секвенирующие праймеры. После завершения ПЦР очистите и сконцентрируйте два образца с помощью комплекта для очистки ДНК и концентратора, а также отправьте фрагмент ДНК на секвенирование Сэнгера, используя праймеры прямого и обратного секвенирования. Все направляющие РНК должны быть сгруппированы вместе с минимальными или отсутствующими перекрывающимися областями между направляющими РНК во время генерации материнского CRISPR.
Если были созданы инделы, мазок должен наблюдаться в введенных образцах на агарозном геле, но не в неинъецированном контроле. Материнский метод CRISPR может быть использован для фенокопии известных мутаций материнского эффекта, таких как пестрая, тми и аура. Чтобы идентифицировать генетические поражения, которые способствуют материнскому CRISPR-фенотипу, обработанные УФ-излучением сперматозоиды и экстракорпоральное оплодотворение объединяются для создания материнских гаплоидов CRISPR.
Создание гаплоида позволяет Сэнгеру секвенировать материнский аллель и идентифицировать материнские ИНДЕЛИ CRISPR. При выявлении фенотипа нематериального эффекта важно, чтобы вы могли наблюдать его у нескольких женщин F0, потому что это увеличивает вероятность того, что фенотип вызван потерей функции, а не нецелевыми или неспецифическими эффектами. После того, как фенотип материнского эффекта был идентифицирован, материнские эмбрионы CRISPR могут быть использованы для изучения влияния на различные аспекты раннего эмбриогенеза, такие как синусовый скелет или сегрегация ДНК.
Это позволяет исследователям понять молекулярную причину фенотипа. Этот метод непосредственно проверяет функцию неизвестных матерински экспрессированных генов в одном поколении, ускоряя наше понимание процессов, действующих во время раннего эмбриогенеза.
