Die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene während der frühen Entwicklung ist derzeit unbekannt. Diese mütterliche CRISPR-Technik ermöglicht die schnelle Identifizierung von mütterlichen Effektgenen und ihrer Rolle bei der Entwicklung. Multiplexing führt RNAs zu einem einzigen Gen, ermöglicht es Forschern, neue mütterliche Effekt-Phänotypen in einer einzigen Generation zu identifizieren.
Diese Forschung ist nützlich, um die Funktion von mRNA-Transkripten in den Gameten zu verstehen, die für die frühe Embryogenese notwendig sind. Der Schlüssel zu dieser Technik besteht darin, die Embryonen früh im Einzellstadium zu injizieren und zu überprüfen, ob die Mehrheit der Guide-RNAs somatische Mutationen in den injizierten Embryonen verursachen kann. Um eine RNA-Leitvorlage für jedes genspezifische Oligonukleotid zu erstellen, analytieren Sie das konstante Oligonukleotid und füllen Sie die Überhänge mit T4-DNA-Polymerase.
Nachdem die vier Guide-RNA-Templates zusammengesetzt sind, reinigen und konzentrieren Sie sie zusammen mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit. Synthetisieren Sie die sgRNA-Mischung aus der gepoolten Guy-RNA-Vorlage unter Verwendung eines In-vitro-T7-Transkriptionskits und führen Sie die In-vitro-Transkription wie im Manuskript beschrieben durch. Um die Integrität der sgRNA zu überprüfen, gießen Sie ein 1% Agarose 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, Ethidiumbromid Tris-Borat-EDTA-Gel.
Legen Sie das verfestigte Gel in Tris-Borat-EDTA-Laufpuffer. Mischen Sie eine Mikroliter-sgRNA-Mischung und einen Mikroliter-RNA-Gel-Ladepuffer. Laden Sie diese Probe in das Gel und lassen Sie das Gel fünf Minuten lang bei 100 Volt laufen.
Visualisieren Sie die Bänder mit ultraviolettem Licht. Stellen Sie Wildtypkreuzungen und Zebrafisch-Paarungsboxen auf. Halten Sie den männlichen und den weiblichen Fisch im selben Tank, aber trennen Sie sie mit einem Paarungskastenteiler oder wie hier gezeigt, indem Sie das Weibchen in einen Eiablageeinsatz legen.
Nachdem der Injektionscocktail zusammengesetzt ist, lassen Sie das Männchen und das Weibchen paaren, indem Sie den Trennkastenteiler entfernen oder, wie hier gezeigt, indem Sie das Männchen in den gleichen Eiablageeinsatz wie das Weibchen legen. Um die Embryonen zu synchronisieren, sammeln Sie sie nach 10 Minuten mit einem Kunststoffsieb und spülen Sie sie mit 1XE3-Medien in eine Petrischale aus. Entfernen Sie 10 bis 15 Embryonen und legen Sie sie in eine separate Petrischale, um sie als nicht injizierte Kontrollen aufzubewahren.
Die restlichen Embryonen werden in die Vertiefungen der Injektionsplatte überführt. Injizieren Sie eine Nanoliter-Protein-sgRNA-Lösung in die sich entwickelnde Blastoscheibe eines einzelligen Embryos. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze der verstopften Nadel zu brechen, und kalibrieren Sie die Nadel neu, um einen Ein-Nanoliter-Bolus auszustoßen.
Am nächsten Tag nach der Injektion sechs gesunde injizierte Embryonen und zwei Kontrollembryonen von der nicht injizierten Platte entnehmen. Legen Sie jeden Embryo einzeln in eine einzelne Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens und beschriften Sie die Oberseite der Röhrchen. Entwerfen Sie einzigartige Screening-Primer für jede Guide-Site, um ein 100 bis 110 Basen-gepaartes DNA-Fragment zu amplifizieren, das die CRISPR-Cas9-Zielstelle enthält.
Wenn möglich, platzieren Sie die Zielstelle in der Mitte des amplifizierten Fragments, um größere Deletionen zu identifizieren. Richten Sie für jede der vier Leitzielstellen acht 25-Mikroliter-PCR-Reaktionen unter Verwendung von fünf Mikrolitern der vorbereiteten einzelnen embryogenomischen DNA und 20 Mikrolitern der PCR-Mischung ein und leiten Sie spezifische Screening-Primer-Mischungen, um somatische Mutationen in der Zielstelle zu identifizieren. Gießen Sie ein 2,5% Agarose, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid Tris-Borat-EDTA-Gel mit Kämmen, die etwa 0,625 Zentimeter breite Vertiefungen erzeugen.
Anschließend wird das erstarrte Gel in die Elektrophoresekammer gegeben, die Tris-Borat-EDTA-Laufpuffer enthält. Fügen Sie dem PCR-Produkt fünf Mikroliter 6X-Ladefarbstoff hinzu. Laden Sie 25 Mikroliter dieser Mischung in das Gel, um sicherzustellen, dass die injizierten und Kontrollproben auf derselben Gelreihe laufen.
Nachdem alle Proben geladen sind, fügen Sie fünf Mikroliter Ethidiumbromid pro Liter Tris-Borat-EDTA-Laufpuffer zum positiven Ende der Gelbox hinzu. Lassen Sie das Gel mit 120 Volt laufen, bis sich die DNA-Verbote auflösen oder die DNA sich dem Ende der Spur genähert hat. Um die mütterlichen Effektphänotypen und die mütterlichen CRISPR-Embryonen zu identifizieren, richteten Sie die injizierten F0-Weibchen gegen Wildtyp-Männchen ein und kontrollierten Wildtypkreuzungen in Standard-Zebrafisch-Paarungsboxen am Nachmittag vor dem Experiment.
Setzen Sie den männlichen und weiblichen Fisch in dasselbe Becken, aber trennen Sie sie mit einem Paarungskastentrenner oder legen Sie das Weibchen in einen Eiablageeinsatz. Lassen Sie das Männchen und das Weibchen am Morgen des Experiments mit der Paarung beginnen, indem Sie den Trennkasten entfernen oder das Männchen in den gleichen Eiablageeinsatz wie das Weibchen legen. Sammeln Sie die Embryonen alle 10 Minuten, indem Sie den Eiablageeinsatz in einen neuen Paarungstankboden bewegen, der frisches Systemwasser enthält, und den Tank mit einem Etikett beschriften, das das einzelne F0-Weibchen identifiziert.
Nehmen Sie das alte Paarungsbecken und gießen Sie das Wasser durch ein T-Sieb, um die Embryonen von einem einzelnen 10-Minuten-Gelege zu sammeln. Beobachten Sie unter einem Seziermikroskop mit einer transzendenten Lichtquelle die Entwicklung der Embryonen jede Stunde, in den ersten sechs bis acht Stunden und täglich in den nächsten fünf Tagen. Bringen Sie die potenziellen mütterlichen CRISPR-Embryonen in eine Petrischale, die 1XE3-Medien enthält, und testen Sie den morphologischen Phänotyp 24 Stunden nach der Befruchtung und die Lebensfähigkeit fünf Tage nach der Befruchtung.
Stellen Sie am Nachmittag vor dem Experiment Paarungspaare von F0-Weibchen auf, indem Sie die Wildtyp-Männchen physisch von den Weibchen trennen, einen Paarungskastenteiler verwenden oder das Weibchen in den Eiablageeinsatz legen. Entfernen Sie am Morgen des Experiments die physische Trennwand, um die Paarung einzuleiten. Beim ersten Anzeichen einer Eiablage unterbrechen Sie die Brut, indem Sie das Männchen und das F0-Weibchen trennen, und halten Sie jedes getrennte F0-Weibchen in einzelnen Paarungsboxen.
Lassen Sie nach der In-vitro-Fertilisation die haploiden Embryonen sich entwickeln, bis der mütterliche CRISPR-Phänotyp beobachtet ist, und legen Sie diese Embryonen in eine andere Petrischale. Sobald die mütterlichen haploiden CRISPR-Embryonen identifiziert wurden, lassen Sie sie mindestens sechs Stunden nach der Befruchtung entwickeln. Um die genomische DNA aus mindestens 10 mütterlichen haploiden CRISPR-Embryonen zu extrahieren, legen Sie einen einzelnen haploiden Embryo in eine einzelne Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens, entfernen Sie überschüssige E3-Medien aus der Vertiefung und fügen Sie 50 Mikroliter 50 Millimolar-Natriumhydroxid hinzu.
Inkubieren Sie die Embryonen für 20 Minuten bei 95 Grad Celsius und kühlen Sie sie auf vier Grad Celsius ab. Dann fügen Sie fünf Mikroliter einer molaren Tris-Salzsäure mit pH 7,5 hinzu und wirbeln Sie für fünf bis 10 Sekunden. Um zu identifizieren, welche Leitstellen Indels enthalten, entwerfen Sie Sequenzierungsprimer, um ein DNA-Fragment einschließlich aller vier CRISPR/Cas9-Zielstellen zu amplifizieren.
Richten Sie zwei 25 Mikroliter PCR-Reaktionen pro Embryo ein, wobei fünf Mikroliter der vorbereiteten genomischen DNA und die Sequenzierungsprimer verwendet werden. Nachdem die PCR abgeschlossen ist, reinigen und konzentrieren Sie die beiden Proben mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit und reichen das DNA-Fragment unter Verwendung der Vorwärts- und Rückwärtssequenzierungsprimer an die Sanger-Sequenzierung ein. Guide-RNAs sollten alle zusammen mit minimalen bis keinen überlappenden Regionen zwischen Guide-RNAs während der mütterlichen CRISPR-Erzeugung geclustert werden.
Wenn Indels erzeugt wurden, sollte ein Abstrich in den injizierten Proben auf einem Agarosegel beobachtet werden, nicht jedoch in der nicht injizierten Kontrolle. Die mütterliche CRISPR-Methode kann verwendet werden, um bekannte mütterliche Effektmutationen wie Kunterbunt, TMI und Aura zu phänokopieren. Um die genetischen Läsionen zu identifizieren, die zum mütterlichen CRISPR-Phänotyp beitragen, werden UV-behandelte Spermien und In-vitro-Fertilisation kombiniert, um mütterliche CRISPR-Haploiden zu erzeugen.
Die Schaffung eines haploiden Prozesses ermöglicht die Sanger-Sequenzierung des mütterlichen Allels und die Identifizierung mütterlicher CRISPR-Indels. Bei der Identifizierung eines unmaternalen Effektphänotyps ist es wichtig, dass Sie ihn bei mehreren F0-Frauen beobachten können, da dies die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass der Phänotyp durch Funktionsverlust verursacht wird, nicht durch Ziel- oder unspezifische Effekte. Nachdem ein mütterlicher Effektphänotyp identifiziert wurde, können die mütterlichen CRISPR-Embryonen verwendet werden, um die Auswirkungen auf verschiedene Aspekte der frühen Embryogenese, wie das Sinusskelett oder die DNA-Segregation, zu untersuchen.
Dies ermöglicht es den Forschern, die molekulare Ursache des Phänotyps zu verstehen. Diese Methode testet direkt die Funktion unbekannter mütterlich exprimierter Gene in einer einzigen Generation und beschleunigt unser Verständnis von Prozessen, die während der frühen Embryogenese wirken.
