鸡重组肢体测定，以了解细胞分化的形态发生，图案化和早期步骤

重组肢体是研究体内环境中胚胎信号影响下细胞分化和力量形成过程的强大模型。该测定允许多种变异，允许潜在的应用，而不局限于鸡肢发育生物学。它可以应用于其他生物的其他茎或祖细胞。

首先，在三天半后从孵化器中取出种蛋，用70%乙醇拭子，然后让它们风干。接下来，通过坎德卵子和观察血管来识别和定位发育中的胚胎。丢弃没有胚胎的卵子。

用一对钝镊子的末端轻敲蛋壳的钝端，打开一扇窗户，用镊子取下大约一平方厘米的蛋壳。然后将鸡蛋转移到塑料或纸箱架上。将卵子一个接一个地放在立体显微镜下。

识别空气膜，并通过在没有任何容器的区域中拾取一个小孔来将其移除。借助精细的手术镊子将该区域拉出，并取出与胚胎接触的蛋壳碎片。用精细的手术镊子撕开羊膜囊。

用钝镊子小心地将胚胎从卵子中取出，并将其转移到含有冰冷的1x PBS的无菌培养皿中。在冰冷的1x PBS中洗涤胚胎一次，并在立体显微镜下取出任何剩余的膜。然后找到后肢芽。

纵向剪裁每个后肢芽，用精细的手术镊子非常靠近胚胎侧腹。将胚胎维持在1x PBS中。然后将肢体芽转移到带有塑料移液管的1.5毫升微量离心管中。

接下来，用500微升0.5%胰蛋白酶溶液代替PBS。将肢体芽在37摄氏度的热块中孵育7分钟。然后用500微升的2毫克/毫升HBSS中4型胶原酶替换胰蛋白酶溶液，并将其在热阻滞中再孵育八分钟。

尽可能多地去除胶原酶，并用一毫升含有10%FBS的冷高糖DMEM代替它，以使酶失活。轻轻移液混合物约10次。用70微米细胞过滤器过滤含有细胞的悬浮液，以留下外皮。

再次移液悬浮液约5至10次，并在室温下以200倍g离心5分钟。然后丢弃上清液。用一毫升培养基洗涤多余的胶原酶，然后离心悬浮液并小心丢弃培养基。

接下来，在不干扰细胞的情况下加入1.5毫升培养基，并在37摄氏度的热块中孵育1至1.5小时，使细胞形成致密的沉淀。获得后肢芽后，用塑料移液管将它们转移到空的微型离心管中。去除任何多余的1x PBS，并在无菌1x PBS中用500微升0.5%胰蛋白酶代替。

将混合物在37摄氏度下在热块中孵育30分钟。将胰蛋白酶溶液与肢体芽转移到无菌培养皿中。然后尽可能多地去除多余的胰蛋白酶，并用冰冷的1x PBS和10%FBS淹没培养皿，直到所有肢体芽都被覆盖。

识别立体显微镜下的肢体芽。接下来，将外胚层识别为从肢体中胚层细胞中略微分离的透明膜。用镊子用细小的手术镊子固定肢体芽的最近端，分离和分离外胚层。

从前面的步骤中取出中胚层颗粒，并丢弃约600微升的培养基。然后用移液器尖端小心地分离颗粒，不要将其砸碎。将管子倒置以将颗粒转移到含有空外胚层的培养皿中。

用一对细小的手术镊子切下一小块颗粒，并将其尽可能靠近外胚层。用手术镊子打开外胚层，并将颗粒尽可能紧密地放入外胚层大厅。打开前肢附近的羊膜囊，露出胚胎的右侧。

在前肢位置的指导下，用钨针进行缠绕刮擦，长度为两到三个索米特，轻微损坏中胚层直至出血。将重组肢体单独转移到雏鸡胚胎中，将其基部放在疙瘩伤口上。用两根钯线正确固定重组肢体。

将重组肢体的基部与伤口对齐。用胶带密封窗口，然后将种蛋放回孵化器。在成功植入时，重组肢体被观察到为牢固附着在供体胚胎的中胚层壁上的突起。

相反，重组肢体从中胚层壁上脱落，或者当细胞活力或移植物失败时呈现出粗糙的形态。阿尔西安蓝染色在六天的鸡，鸡重组肢体中表现出骨骼元素。在清除Alcian蓝色之前，在乙醇中获得图像以进行形态学和定量测量。

将H&E染色或未染色的肢体切片以观察组织和细胞。该技术可以在体内开发肢体类器官，并使用来自不同来源或物种的干细胞来研究细胞分化或形态发生过程。