組換え四肢は、in vivo環境における胚性シグナルの影響下での細胞分化およびパワー形成の過程における研究のための強力なモデルである。このアッセイは、鶏肢の発生生物学に限定されることなく、潜在的な用途を可能にする複数のバリエーションを可能にします。これは、他の生物からの他の茎または前駆者に適用することができる。
まず、3日半後にインキュベーターから卵を取り出し、70%エタノールで綿棒で拭き取り、風乾させてください。次に、卵子を傾けて血管を観察することによって、発達中の胚を特定し、位置を特定する。胚を持たない卵子を捨てる。
一対の鈍い鉗子の端で卵の殻の鈍い端をタップして窓を開き、鉗子を使って殻の約1平方センチメートルを取り除きます。その後、卵をプラスチックまたはカートンホルダーに移します。卵を実体顕微鏡の下に置きます。
空気膜を特定し、容器のない領域に小さな穴を開けて取り除きます。細かい外科用鉗子の助けを借りてこの領域を引き出し、胚と接触している卵殻の破片を取り除きます。羊膜嚢を細かい外科用鉗子で裂く。
鈍い鉗子で卵から胚を慎重に取り出し、氷冷した1x PBSを含む滅菌ペトリ皿に移す。氷冷1x PBSで胚を一度洗浄し、残りの膜を実体顕微鏡下で取り出す。次に、後肢の芽を見つけます。
各後肢の芽を縦方向に切り取り、胚の側面に非常に近いものを細かい外科的鉗子で切断する。胚を1x PBSで維持する。次に、四肢の芽をプラスチック転写ピペットで1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
次に、PBSを500マイクロリットルの0.5%トリプシン溶液と交換する。四肢の芽をサーモブロックで摂氏37度で7分間孵化させる。次いで、トリプシン溶液をHBSS中の4型コラゲナーゼ1ミリリットル当たり2ミリグラムの500マイクロリットルと交換し、それをサーモブロック中でさらに8分間インキュベートする。
できるだけ多くのコラゲナーゼを除去し、1ミリリットルの低温高グルコースDMEMと10%FBSと交換して酵素を失活させる。混合物を10回程度穏やかにピペットで挽く。細胞を含む懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーでろ過し、外胚葉を残します。
懸濁液を再び5〜10回程度ピペットし、室温で5分間200倍gで遠心分離した。その後、上清を捨てる。余分なコラゲナーゼを1ミリリットルの培地で洗浄し、懸濁液を遠心分離し、培地を慎重に廃棄する。
次に、細胞を乱すことなく1.5ミリリットルの培地を加え、サーモブロック内で摂氏37度で1〜1.5時間インキュベートし、細胞がコンパクトなペレットを形成できるようにします。後肢の芽を得た後、プラスチックピペットで空のマイクロ遠心チューブに移す。余分な1x PBSを除去し、滅菌1x PBS中の500マイクロリットルの0.5%トリプシンと交換する。
混合物をサーモブロック中で摂氏37度で30分間インキュベートする。四肢の芽を持つトリプシン溶液を滅菌ペトリ皿に移す。その後、余分なトリプシンをできるだけ多く取り除き、すべての四肢の芽が覆われるまで、氷冷した1x PBSを10%FBSでペトリ皿に浸します。
実体顕微鏡下で四肢の芽を特定する。次に、外胚葉を四肢中胚葉系細胞からわずかに剥離した透明な膜として同定する。細かい外科的鉗子で四肢芽の最も近位端を保持する鉗子で外胚葉を切り離して分離する。
前のステップから中胚葉ペレットを取り、約600マイクロリットルの培地を捨てる。その後、ペレットを粉砕せずにピペットチップで慎重に取り外します。チューブを逆さまにして、空の外胚葉を含むペトリ皿にペレットを移します。
ペレットの小片を一対の細かい外科用鉗子で切断し、外胚葉にできるだけ近づける。外胚葉を外科用鉗子で開き、ペレットを外胚葉ホールにできるだけしっかりと置きます。前肢近くの羊膜嚢を開き、胚の右脇腹を露出させる。
前肢の位置に導かれて、タングステン針で2〜3個のソマイトの長さに創傷引っ掻き傷を行い、出血するまで中胚葉をわずかに損傷する。組換え肢を雛胚に個々に移し、その基部をソマイト創傷の上に置く。組換え肢を2本のパラジウム線で正しく固定します。
組換え四肢の基部を創傷に合わせる。窓をテープで密封し、卵をインキュベーターに戻します。移植の成功において、組換え四肢は、ドナー胚の中胚葉壁に確実に付着した隆起として観察された。
それどころか、組換え四肢は中胚葉壁から剥離したか、または細胞生存率または移植片のいずれかが失敗したときに大まかな形態を示した。アルシアンブルー染色は、6日間のニワトリ、ニワトリ組換え四肢において骨格要素を示した。アルシアンブルーをクリアする前に、形態学的および定量的測定のためにエタノール中の画像が得られた。
H&E染色または染色されていない四肢をスライスし、組織および細胞を観察した。この技術は、インビボで四肢オルガノイドを開発し、異なる供給源または種からの幹細胞を使用して細胞分化または形態形成プロセスを研究することができる。
