Las extremidades recombinantes son un modelo poderoso para un estudio en el proceso de diferenciación celular y formación de potencia bajo la influencia de señales embrionarias en un entorno in vivo. Este ensayo permite múltiples variaciones que permiten aplicaciones potenciales sin estar restringido a la biología del desarrollo de las extremidades de pollo. Se puede aplicar a otro tallo o progenitor de otros organismos.
Para comenzar, retire los huevos de la incubadora después de tres días y medio, frote con etanol al 70% y déjelos secar al aire. A continuación, identifique y localice los embriones en desarrollo candling el óvulo y observando los vasos sanguíneos. Deseche los óvulos que no tengan un embrión.
Toque el extremo romo de la cáscara del huevo con el extremo de un par de fórceps romos para abrir una ventana y retire aproximadamente un centímetro cuadrado de la cáscara con las pinzas. Luego transfiera los huevos a un soporte de plástico o cartón. Coloque los huevos uno por uno debajo del estereomicroscopio.
Identifique la membrana de aire y retírela haciendo un pequeño agujero en el área sin vasos. Extraiga esta área con la ayuda de fórceps quirúrgicos finos y retire trozos de cáscara de huevo en contacto con el embrión. Abra el saco amniótico con fórceps quirúrgicos finos.
Retire cuidadosamente el embrión del huevo con fórceps contundentes y transfiéralo a una placa de Petri estéril que contenga 1x PBS helado. Lave los embriones una vez en 1x PBS helado y retire las membranas restantes debajo del estereomicroscopio. Luego ubique los brotes de las extremidades posteriores.
Corta cada yema de la extremidad posterior longitudinalmente, cortando muy cerca del flanco embrionario con pinzas quirúrgicas finas. Mantener los embriones en 1x PBS. Luego transfiera los brotes de las extremidades a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros con una pipeta de transferencia de plástico.
A continuación, reemplace el PBS con 500 microlitros de solución de tripsina al 0.5%. Incubar los brotes de las extremidades en un termobloqueo durante siete minutos a 37 grados centígrados. Luego reemplace la solución de tripsina con 500 microlitros de dos miligramos por mililitro de colagenasa tipo cuatro en HBSS e incube en el termobloqueo durante otros ocho minutos.
Elimine la mayor cantidad de colagenasa posible y reemplácela con un mililitro de DMEM frío de alta glucosa con 10% FBS para inactivar las enzimas. Pipetear la mezcla suavemente alrededor de 10 veces. Filtre la suspensión que contiene las células con un colador de células de 70 micrómetros para dejar atrás los ectodermos.
Vuelva a pipetear la suspensión alrededor de cinco a 10 veces y centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego descarte el sobrenadante. Lave el exceso de colagenasa con un mililitro de medios, luego centrifugue la suspensión y deseche el medio con cuidado.
A continuación, agregue 1.5 mililitros de medios sin perturbar las células e incube durante una a 1.5 horas a 37 grados Celsius en un termobloqueo, permitiendo que las células formen un gránulo compacto. Después de obtener los brotes de las extremidades posteriores, transfiéralos a un tubo de micro centrífuga vacío con una pipeta de plástico. Retire cualquier exceso de 1x PBS y reemplácelo con 500 microlitros de tripsina al 0.5% en 1x PBS estéril.
Incubar la mezcla durante 30 minutos a 37 grados centígrados en un termobloqueo. Transfiera la solución de tripsina con los brotes de las extremidades a una placa de Petri estéril. Luego retire la mayor cantidad posible del exceso de tripsina e inunde la placa de Petri con 1x PBS helado con 10% FBS hasta que todos los brotes de las extremidades estén cubiertos.
Identifique las yemas de las extremidades debajo del estereomicroscopio. A continuación, identifique el ectodermo como una membrana transparente ligeramente separada de las células mesodérmicas de la extremidad. Separe y separe el ectodermo con fórceps que sostengan el extremo más proximal de la yema de la extremidad con fórceps quirúrgicos finos.
Tome el pellet mesodérmico de los pasos anteriores y deseche alrededor de 600 microlitros del medio. Luego, separe cuidadosamente el pellet con una punta de pipeta sin romperlo. Gire el tubo boca abajo para transferir el pellet a la placa de Petri que contiene los ectodermos vacíos.
Cortar un pequeño trozo del pellet con un par de pinzas quirúrgicas finas y colocarlo lo más cerca posible del ectodermo. Abra el ectodermo con las pinzas quirúrgicas y coloque el gránulo lo más firmemente posible en la sala ectodérmica. Abra el saco amniótico cerca de la extremidad anterior para exponer el flanco derecho del embrión.
Guiado por la posición de la extremidad anterior, realice el rascado de la herida con una aguja de tungsteno de la longitud de dos a tres somitas, dañando ligeramente el mesodermo hasta que sangre. Transfiera individualmente las extremidades recombinantes al embrión de pollito, colocando su base sobre una herida somita. Fije la extremidad recombinante correctamente con dos piezas de alambre de paladio.
Alinee la base de la extremidad recombinante con la herida. Selle la ventana con cinta adhesiva y devuelva el huevo a la incubadora. En la implantación exitosa, la extremidad recombinante se observó como una protuberancia que se unió de forma segura a la pared mesodérmica del embrión donante.
Por el contrario, la extremidad recombinante se desprendió de la pared mesodérmica o presentó una morfología rugosa cuando falló la viabilidad celular o el injerto. La tinción azul alcian demostró elementos esqueléticos en una extremidad recombinante de pollo de seis días. Antes de limpiar el azul alciano, se obtuvieron imágenes en etanol para mediciones morfológicas y cuantitativas.
Las extremidades teñidas o no manchadas de H&E se cortaron en rodajas para observar tejidos y células. Esta técnica puede desarrollar organoides de extremidades in vivo y estudiar la diferenciación celular o el proceso morfogenético mediante el uso de células madre de diferentes fuentes o especies.
