Rekombinant uzuvlar, in vivo bir ortamda embriyonik sinyallerin etkisi altında hücre farklılaşması ve güç oluşumu sürecinde yapılan bir çalışma için güçlü bir modeldir. Bu tahlil, tavuk uzuv gelişim biyolojisi ile sınırlı kalmadan potansiyel uygulamalara izin veren çoklu varyasyonlara izin verir. Diğer organizmalardan diğer kök veya atalara uygulanabilir.
Başlamak için, üç buçuk gün sonra kuluçka makinesinden yumurtaları çıkarın,% 70 etanol ile silin ve havada kurumaya bırakın. Daha sonra, yumurtayı konserve ederek ve kan damarlarını gözlemleyerek gelişmekte olan embriyoları tanımlayın ve bulun. Embriyosu olmayan yumurtaları atın.
Bir pencere açmak ve forsepsleri kullanarak kabuğun yaklaşık bir santimetrekaresini çıkarmak için yumurta kabuğunun künt ucuna bir çift künt forseps ucuyla dokunun. Daha sonra yumurtaları plastik veya karton bir tutucuya aktarın. Yumurtaları stereomikroskop altına tek tek yerleştirin.
Hava membranını tanımlayın ve herhangi bir damar olmadan alanda küçük bir delik açarak çıkarın. Bu bölgeyi ince cerrahi forseps yardımıyla dışarı çekin ve embriyo ile temas eden yumurta kabuğu parçalarını çıkarın. Amniyotik kesesi ince cerrahi forseps ile yırtarak açın.
Embriyoyu künt forseps ile yumurtadan dikkatlice çıkarın ve buz gibi soğuk 1x PBS içeren steril bir Petri kabına aktarın. Embriyoları buz gibi soğuk 1x PBS'de bir kez yıkayın ve kalan zarları stereomikroskop altında çekin. Sonra arka bacak tomurcuklarını bulun.
Her bir arka bacak tomurcuğunu, ince cerrahi forseps ile embriyo kanadına çok yakın keserek uzunlamasına kesin. Embriyoların 1x PBS'de tutulması. Daha sonra uzuv tomurcuklarını plastik bir transfer pipeti ile 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra, PBS'yi 500 mikrolitre% 0.5 tripsin çözeltisi ile değiştirin. Uzuv tomurcuklarını 37 santigrat derecede yedi dakika boyunca bir termoblokta kuluçkaya yatırın. Daha sonra tripsin çözeltisini HBSS'de mililitre kollajenaz tip dört başına 500 mikrolitre iki miligram ile değiştirin ve termoblokta sekiz dakika daha inkübe edin.
Mümkün olduğunca fazla kollajenaz çıkarın ve enzimleri inaktive etmek için% 10 FBS ile bir mililitre soğuk yüksek glikoz DMEM ile değiştirin. Karışımı yaklaşık 10 kez hafifçe pipetleyin. Ektodermleri geride bırakmak için hücreleri içeren süspansiyonu 70 mikrometrelik bir hücre süzgeci ile filtreleyin.
Süspansiyonu tekrar yaklaşık beş ila 10 kez pipetleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın. Sonra süpernatantı atın. Fazla kollajenazı bir mililitre ortamla yıkayın, ardından süspansiyonu santrifüj edin ve ortamı dikkatlice atın.
Daha sonra, hücreleri rahatsız etmeden 1,5 mililitre ortam ekleyin ve hücrelerin kompakt bir pelet oluşturmasına izin vererek bir termoblokta 37 santigrat derecede bir ila 1,5 saat boyunca inkübe edin. Arka ekstremite tomurcuklarını elde ettikten sonra, bunları plastik pipetli boş bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Fazla 1x PBS'yi çıkarın ve steril 1x PBS'de 500 mikrolitre% 0.5 tripsin ile değiştirin.
Karışımı bir termoblok içinde 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Tripsin çözeltisini uzuv tomurcukları ile steril bir Petri kabına aktarın. Daha sonra fazla tripsinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve Petri kabını, tüm uzuv tomurcukları kaplanana kadar% 10 FBS ile buz gibi soğuk 1x PBS ile doldurun.
Stereomikroskop altında uzuv tomurcuklarını tanımlayın. Daha sonra, ektodermi, ekstremite mezodermal hücrelerinden hafifçe ayrılmış şeffaf bir zar olarak tanımlayın. Ekstremite tomurcuğunun en proksimal ucunu tutan forseps ile ince cerrahi forseps ile ayırın ve ayırın.
Mezodermal peleti önceki adımlardan alın ve ortamın yaklaşık 600 mikrolitresini atın. Daha sonra peleti parçalamadan bir pipet ucuyla dikkatlice ayırın. Peleti boş ektodermleri içeren Petri kabına aktarmak için tüpü baş aşağı çevirin.
Peletin küçük bir parçasını bir çift ince cerrahi forseps ile kesin ve ektoderme mümkün olduğunca yakın yerleştirin. Ektodermi cerrahi forseps ile açın ve peleti ektodermal salona mümkün olduğunca sıkı bir şekilde yerleştirin. Embriyonun sağ kanadını ortaya çıkarmak için ön ayağın yakınındaki amniyotik kesesi açın.
Ön ayak pozisyonu tarafından yönlendirilerek, bir tungsten iğne ile iki ila üç somit uzunluğunda yara tırmalama işlemini gerçekleştirin ve kanayana kadar mezoderme hafifçe zarar verin. Rekombinant uzuvları ayrı ayrı civciv embriyosuna aktarın ve tabanını bir somit yarasının üzerine yerleştirin. Rekombinant uzuvları iki parça paladyum teli ile doğru şekilde sabitleyin.
Rekombinant ekstremitenin tabanını yara ile hizalayın. Pencereyi bantla kapatın ve yumurtayı inkübatöre geri verin. Başarılı implantasyonda, rekombinant ekstremite, donör embriyonun mezodermal duvarına güvenli bir şekilde tutturulmuş bir çıkıntı olarak gözlendi.
Aksine, rekombinant ekstremite mezodermal duvardan ayrıldı veya hücre canlılığı veya greft başarısız olduğunda kaba bir morfoloji sundu. Alcian mavisi boyama, altı günlük bir tavuk, tavuk rekombinant uzuvda iskelet elementleri gösterdi. Alcian mavisini temizlemeden önce, morfolojik ve kantitatif ölçümler için etanoldeki görüntüler elde edildi.
H&E lekeli veya lekesiz uzuvlar, dokuları ve hücreleri gözlemlemek için dilimlendi. Bu teknik, ekstremite organoidlerini in vivo olarak geliştirebilir ve farklı kaynaklardan veya türlerden kök hücreleri kullanarak hücre farklılaşmasını veya morfogenetik süreci inceleyebilir.
