גפיים רקומביננטיות הן מודל רב עוצמה למחקר בתהליך של התמיינות תאים ויצירת כוח בהשפעת אותות עובריים בסביבה in vivo. בדיקה זו מאפשרת וריאציות מרובות המאפשרות יישומים פוטנציאליים מבלי להיות מוגבלים לביולוגיה התפתחותית של גפיים עוף. זה יכול להיות מיושם על גזע אחר או אב קדמון מאורגניזמים אחרים.
כדי להתחיל, להסיר ביצים מן האינקובטור לאחר שלושה וחצי ימים, ספוגית עם 70% אתנול, ולהשאיר אותם לאוויר יבש. לאחר מכן, זהה ואתר את העוברים המתפתחים על ידי תפירת הביצית והתבוננות בכלי הדם. השליכו ביציות שאין להן עובר.
הקש על הקצה הקהה של קליפת הביצה עם קצה של זוג מלקחיים קהים כדי לפתוח חלון ולהסיר כסנטימטר מרובע אחד של הקליפה באמצעות המלקחיים. לאחר מכן מעבירים את הביצים למחזיק פלסטיק או קרטון. הניחו את הביצים בזו אחר זו מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
זהה את קרום האוויר והסר אותו על ידי בחירת חור קטן באזור ללא כלי דם. משכו את האזור הזה החוצה בעזרת מלקחיים כירורגיים עדינים והסירו חתיכות של קליפת ביצה במגע עם העובר. לקרוע לפתוח את שק מי השפיר עם מלקחיים כירורגיים עדינים.
יש להסיר בזהירות את העובר מהביצית עם מלקחיים קהים ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי סטרילית המכילה 1x PBS קר כקרח. לשטוף את העוברים פעם אחת ב- PBS 1x קר כקרח ולמשוך את כל הממברנות הנותרות מתחת לסטריאומיקרוסקופ. לאחר מכן אתרו את הניצנים האחוריים.
חותכים כל ניצן אחורי באורך, חותכים קרוב מאוד לאגף העובר עם מלקחיים כירורגיים עדינים. שמירה על העוברים ב-1x PBS. לאחר מכן מעבירים את ניצני הגפיים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר עם פיפטת העברת פלסטיק.
לאחר מכן, החלף את ה- PBS ב- 500 מיקרוליטרים של תמיסת טריפסין של 0.5%. דגירה של ניצני הגפיים בגוש תרמי במשך שבע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן החליפו את תמיסת הטריפסין ב-500 מיקרוליטרים של שני מיליגרם למיליליטר קולגן מסוג 4 ב-HBSS והכניסו אותו לתרמו-בלוק למשך שמונה דקות נוספות.
הסר כמה שיותר קולגן והחלף אותו במיליליטר אחד של DMEM עתיר גלוקוז קר עם 10% FBS כדי להשבית את האנזימים. פיפטה את התערובת בעדינות כ-10 פעמים. סנן את ההשעיה המכילה את התאים עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להשאיר מאחור את האקטודרמים.
פיפט את המתלים שוב סביב חמש עד 10 פעמים וצנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. ואז להשליך את supernatant. לשטוף את קולגן עודף עם מיליליטר אחד של מדיה, ולאחר מכן צנטריפוגה את ההשעיה ולהשליך את המדיום בזהירות.
לאחר מכן, מוסיפים 1.5 מיליליטרים של מדיה מבלי להפריע לתאים ומדגרים אותם למשך שעה עד שעה וחצי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במחסום תרמי, מה שמאפשר לתאים ליצור כדור קומפקטי. לאחר קבלת ניצני הגפיים האחוריות, העבירו אותם לצינור מיקרו צנטריפוגה ריק עם פיפטה מפלסטיק. הסר כל עודף 1x PBS והחלף אותו ב- 500 מיקרוליטרים של 0.5% טריפסין ב- PBS סטרילי 1x.
הדגירה של התערובת במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במחסום תרמי. מעבירים את תמיסת הטריפסין עם ניצני הגפיים לתוך צלחת פטרי סטרילית. לאחר מכן הסירו כמה שיותר מהטריפסין העודף והציפו את צלחת הפטרי ב-1x PBS קר כקרח עם 10% FBS עד שכל ניצני הגפיים מכוסים.
זהה את ניצני הגפיים תחת הסטריאומיקרוסקופ. לאחר מכן, זהה את האקטודרם כממברנה שקופה מנותקת מעט מהתאים המזודרמליים של הגפיים. נתקו והפרידו את האקטודרם עם מלקחיים המחזיקים את הקצה הפרוקסימלי ביותר של ניצן הגפיים עם מלקחיים כירורגיים עדינים.
קח את הכדור המזודרמלי מהצעדים הקודמים והשלך כ-600 מיקרוליטרים של המדיום. לאחר מכן נתק בזהירות את הכדור עם קצה פיפטה מבלי לרסק אותו. סובבו את הצינור הפוך כדי להעביר את הכדור לתוך צלחת פטרי המכילה את האקטודרמים הריקים.
חותכים חתיכה קטנה מהכדור עם זוג מלקחיים כירורגיים עדינים ומניחים אותה קרוב ככל האפשר לאקטודרם. פתחו את האקטודרם עם המלקחיים הכירורגיים והניחו את הכדור חזק ככל האפשר לתוך האולם האקטודרמלי. פתחו את שק מי השפיר ליד הפתח הקדמי כדי לחשוף את האגף הימני של העובר.
מונחה על ידי תנוחת הפורלימב, בצע גירוד פצע עם מחט טונגסטן לאורך של שניים עד שלושה סומיטים, תוך פגיעה קלה במזודרם עד שהוא מדמם. מעבירים בנפרד את הגפיים הרקומביננטיות לעובר האפרוח, ומניחים את בסיסו מעל פצע סומיט. תקן את האיבר הרקומביננטי כראוי עם שתי חתיכות של חוט פלדיום.
יישרו את בסיס הגפה הרקומביננטית עם הפצע. אטמו את החלון בנייר דבק והחזירו את הביצה לחממה. בהשתלה מוצלחת, הגפה הרקומביננטית נצפתה כבליטה שהייתה מחוברת היטב לדופן המזודרמלית של העובר התורם.
להיפך, האיבר הרקומביננטי נותק מהדופן המזודרמלית או הציג מורפולוגיה גסה כאשר כדאיות התא או השתל נכשלו. כתמים כחולים אלקיים הדגימו אלמנטים שלדיים באיבר עוף רקומביננטי של עוף בן שישה ימים. לפני ניקוי הכחול האלקי, התקבלו תמונות באתנול למדידות מורפולוגיות וכמותיות.
גפיים מוכתמות או לא מוכתמות של H&E נפרסו כדי לצפות ברקמות ובתאים. טכניקה זו יכולה לפתח אורגנואידים של גפיים in vivo ולחקור התמיינות תאים או תהליך מורפוגנטי על ידי שימוש בתאי גזע ממקורות או מינים שונים.
