Рекомбинантные конечности являются мощной моделью для исследования в процессе дифференцировки клеток и формирования мощности под воздействием эмбриональных сигналов в среде in vivo. Этот анализ допускает несколько вариаций, допускающих потенциальное применение, не ограничиваясь биологией развития куриных конечностей. Он может быть применен к другому стволу или прародителю от других организмов.
Для начала извлеките яйца из инкубатора через три с половиной дня, смажьте 70% этанолом и оставьте их сушиться на воздухе. Затем определите и найдите развивающиеся эмбрионы, поцеловав яйцеклетку и наблюдая за кровеносными сосудами. Выбросьте яйца, у которых нет эмбриона.
Постучите тупым концом яичной скорлупы концом пары тупых щипцов, чтобы открыть окно и удалить около одного квадратного сантиметра скорлупы с помощью щипцов. Затем переложите яйца в пластиковый или картонный держатель. Поместите яйца по одному под стереомикроскоп.
Определите воздушную мембрану и удалите ее, выбрав небольшое отверстие в области без каких-либо сосудов. Вытащите эту область с помощью тонких хирургических щипцов и удалите кусочки яичной скорлупы, контактирующие с эмбрионом. Разорвать амниотический мешок тонкими хирургическими щипцами.
Осторожно извлеките эмбрион из яйца тупыми щипцами и перенесите его в стерильную чашку Петри, содержащую ледяной 1x PBS. Вымойте эмбрионы один раз в ледяном 1x PBS и извлеките все оставшиеся мембраны под стереомикроскопом. Затем найдите почки задних конечностей.
Срезайте каждую почку заднего скольжения продольно, разрезая очень близко к боку эмбриона тонкими хирургическими щипцами. Поддержание эмбрионов в 1x PBS. Затем переложите почки конечностей в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку с пластиковой переносной пипеткой.
Далее замените PBS на 500 микролитров 0,5% раствора трипсина. Высиживайте почки конечностей в термоблоке в течение семи минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем замените раствор трипсина 500 микролитрами двух миллиграммов на миллилитр коллагеназы четвертого типа в HBSS и инкубируйте его в термоблоке еще восемь минут.
Удалите как можно больше коллагеназы и замените ее одним миллилитром холодного высокоуглекового DMEM с 10% FBS для инактивации ферментов. Пипетку смесь аккуратно примерно 10 раз. Отфильтруйте суспензию, содержащую клетки, с помощью 70-микрометрового клеточного ситечка, чтобы оставить после себя эктодермы.
Пипетку снова суспензию примерно в пять-10 раз и центрифугу по 200 раз по г в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем отбросьте супернатант. Вымойте избыток коллагеназы одним миллилитром среды, затем центрифугируйте суспензию и осторожно выбросьте среду.
Далее добавляют 1,5 миллилитра среды, не нарушая клетки, и инкубируют их в течение одного до 1,5 часов при 37 градусах Цельсия в термоблоке, позволяя клеткам образовывать компактную гранулу. После получения бутонов задних конечностей переложите их в пустую микроцентрифужную трубку с пластиковой пипеткой. Удалите избыток 1x PBS и замените его 500 микролитрами 0,5% трипсина в стерильном 1x PBS.
Инкубировать смесь в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия в термоблоке. Переложите раствор трипсина с почками конечностей в стерильную чашку Петри. Затем удалите как можно больше избытка трипсина и затопите чашку Петри ледяным 1x PBS с 10% FBS, пока все почки конечностей не будут покрыты.
Определите почки конечностей под стереомикроскопом. Затем определите эктодерму как слегка отделенную прозрачную мембрану от мезодермальных клеток конечности. Отделите и отделите эктодерму щипцами, удерживающими самый проксимальный конец бутона конечности, тонкими хирургическими щипцами.
Возьмите мезодермальную гранулу с предыдущих этапов и выбросьте около 600 микролитров среды. Затем аккуратно отсоедините гранулу наконечником пипетки, не разбивая ее. Переверните трубку вверх дном, чтобы перенести гранулу в чашку Петри, содержащую пустые эктодермы.
Вырежьте небольшой кусочек гранулы парой тонких хирургических щипцов и поместите его как можно ближе к эктодерме. Откройте эктодерму хирургическими щипцами и поместите гранулу как можно плотнее в эктодермальный зал. Откройте амниотический мешок возле передней конечности, чтобы обнажить правый фланг эмбриона.
Ориентируясь в положение передней конечности, выполняют раневую расчесывание вольфрамовой иглой на длину двух-трех сомитов, слегка повреждая мезодерму до тех пор, пока она не кровоточит. По отдельности перенесите рекомбинантные конечности в эмбрион цыпленка, поместив его основание над раной сомита. Правильно зафиксируйте рекомбинантную конечность двумя кусками палладиевой проволоки.
Выровняйте основание рекомбинантной конечности с раной. Заклейте окно скотчем и верните яйцо в инкубатор. При успешной имплантации рекомбинантная конечность наблюдалась как выступ, который надежно прикреплялся к мезодермальной стенке донорского эмбриона.
Напротив, рекомбинантная конечность была отделена от мезодермальной стенки или представляла грубую морфологию, когда либо жизнеспособность клетки, либо трансплантат не удались. Алциановое синее окрашивание продемонстрировало скелетные элементы в шестидневной куриной рекомбинантной конечности курицы. Перед очисткой алцианского синего цвета были получены изображения в этаноле для морфологических и количественных измерений.
Окрашенные H & E или неокрашенные конечности были разрезаны для наблюдения за тканями и клетками. Этот метод может развивать органоиды конечностей in vivo и изучать дифференцировку клеток или морфогенетический процесс с использованием стволовых клеток из разных источников или видов.
