Os membros recombinantes são um modelo poderoso para um estudo no processo de diferenciação celular e formação de poder sob a influência de sinais embrionários em um ambiente in vivo. Este ensaio permite múltiplas variações que permitem aplicações potenciais sem se restringir à biologia do desenvolvimento de membros de frango. Pode ser aplicado a outros caules ou progenitor de outros organismos.
Para começar, retire os ovos da incubadora após três dias e meio, cotonete com 70% de etanol, e deixe-os secos. Em seguida, identifique e localize os embriões em desenvolvimento, candling o ovo e observando os vasos sanguíneos. Descarte ovos que não tenham um embrião.
Bata na extremidade contundente da casca do ovo com a extremidade de um par de fórceps contundentes para abrir uma janela e remova cerca de um centímetro quadrado da casca usando os fórceps. Em seguida, transfira os ovos para um suporte de plástico ou caixa. Coloque os ovos um a um sob o estereóscópio.
Identifique a membrana de ar e remova-a colhendo um pequeno buraco na área sem vasos. Retire esta área com o auxílio de fórceps cirúrgicos finos e remova pedaços de casca de ovo em contato com o embrião. Abra o saco amniótico com fórceps cirúrgicos finos.
Remova cuidadosamente o embrião do ovo com fórceps sem cortes e transfira-o para uma placa de Petri estéril contendo 1x PBS gelado. Lave os embriões uma vez no 1x PBS gelado e retire quaisquer membranas restantes sob o estereóscópio. Em seguida, localize os botões de subida.
Corte cada broto de subida longitudinalmente, cortando muito perto do flanco do embrião com fórceps cirúrgicos finos. Mantendo os embriões em 1x PBS. Em seguida, transfira os botões do membro para um tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitro com uma pipeta de transferência de plástico.
Em seguida, substitua o PBS por 500 microliters de solução de 0,5% trypsin. Incubar os botões do membro em um termbloco por sete minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, substitua a solução de trippsina por 500 microlitres de dois miligramas por mililitro tipo quatro em HBSS e incuba-o no termbloco por mais oito minutos.
Remova o máximo de colagem possível e substitua-a por um mililitro de DMEM de alta glicose fria com 10% de FBS para inativar as enzimas. Pipeta a mistura suavemente cerca de 10 vezes. Filtre a suspensão contendo as células com um coador de células de 70 micrômetros para deixar para trás os ectodermes.
Pipeta a suspensão novamente em torno de cinco a dez vezes e centrífuga a 200 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Então descarte o supernatante. Lave o excesso de colagem com um mililitro de mídia, depois centrifufique a suspensão e descarte o meio cuidadosamente.
Em seguida, adicione 1,5 mililitros de mídia sem perturbar as células e incuba-as por uma a 1,5 horas a 37 graus Celsius em um termbloco, permitindo que as células formem uma pelota compacta. Depois de obter os botões do membro traseiro, transfira-os para um tubo vazio de micro centrífuga com uma pipeta de plástico. Remova qualquer excesso de 1x PBS e substitua-o por 500 microliters de 0,5% trypsin em PBS 1x estéril.
Incubar a mistura por 30 minutos a 37 graus Celsius em um termbloco. Transfira a solução de trippsina com os botões do membro em uma placa de Petri estéril. Em seguida, remova o máximo possível do excesso de trippsina e inunde a placa de Petri com PBS 1x gelado com 10% FBS até que todos os botões de membros estejam cobertos.
Identifique os botões do membro sob o estereóscópio. Em seguida, identifique o ectoderme como uma membrana ligeiramente separada e transparente das células mesodérmicas do membro. Despeça e separe o ectoderm com fórceps segurando a extremidade mais proximal do broto do membro com fórceps cirúrgicos finos.
Pegue a pelota mesodérmica das etapas anteriores e descarte cerca de 600 microliters do meio. Em seguida, desprender cuidadosamente a pelota com uma ponta de pipeta sem esmagá-la. Vire o tubo de cabeça para baixo para transferir a pelota para a placa de Petri contendo as ectodermes vazias.
Corte um pequeno pedaço da pelota com um par de fórceps cirúrgicos finos e coloque-o o mais perto possível do ectoderm. Abra o ectoderm com os fórceps cirúrgicos e coloque a pelota o mais firmemente possível no salão ectodérmico. Abra o saco amniótico perto do membro dianteiro para expor o flanco direito do embrião.
Guiado pela posição do membro dianteiro, realize arranhões na ferida com uma agulha de tungstênio ao comprimento de dois a três somites, danificando levemente o mesoderm até sangrar. Transfira individualmente os membros recombinantes para o embrião do filhote, colocando sua base sobre uma ferida de somite. Fixar o membro recombinante corretamente com dois pedaços de fio de paládio.
Alinhe a base do membro recombinante com a ferida. Sele a janela com fita adesiva e devolva o ovo para a incubadora. Na implantação bem sucedida, o membro recombinante foi observado como uma protuberância que estava firmemente presa à parede mesodérmica do embrião doador.
Pelo contrário, o membro recombinante foi retirado da parede mesodérmica ou apresentou uma morfologia áspera quando a viabilidade celular ou o enxerto falharam. A coloração azul alciana demonstrou elementos esqueléticos em um frango de seis dias, membro recombinante de frango. Antes de limpar o azul alciano, foram obtidas imagens em etanol para medições morfológicas e quantitativas.
Membros manchados ou não manchados de H&E foram cortados para observar tecidos e células. Esta técnica pode desenvolver organoides de membros in vivo e estudar a diferenciação celular ou processo morfogenético usando as células-tronco de diferentes fontes ou espécies.
