体外 使用表达β半乳糖苷酶的寄生虫针对 克氏锥虫 的所有生命周期阶段进行药物筛选

该协议描述了在克氏锥虫的三个生命周期阶段进行高通量比色测定，以鉴定恰加斯病的新候选药物。这可用于以简单，快速和可重复的方式鉴定杀青剂化合物。演示该过程的将是罗米娜·马纳林，来自帕梅拉婴儿床实验室的实验室细胞培养技术人员。

首先在T-25组织培养瓶中培养表达克氏锥虫表皮鞭毛虫的β半乳糖苷酶，并在28摄氏度下孵育以轴蚜生长它们。使用纽鲍尔室，在传代培养之前量化寄生虫的生长。为了将培养物维持在对数阶段，每48至72小时在5毫升补充10%FCS和硫酸盐遗传素的LIT培养基中以最终浓度为每毫升200微克进行传代培养。

然后牢固地关闭盖子，然后在垂直位置在28摄氏度下孵育。从对数相培养物中，在补充有遗传素和硫酸盐的LIT培养基中以每毫升200，000个细胞的最终浓度每毫升表锄胚珠的载体中制成悬浮液。在每孔分配100微升悬浮液后，用96孔板，用培养基200微升的孔进行最终补液。

使VERO细胞悬浮液在DMEM中补充2%FCS，最终浓度为每毫升100， 000个细胞。在96孔组织培养板中每孔接种100微升悬浮液。将细胞孵育过夜以进行粘附，第二天在显微镜下观察细胞。

第二天，用100微升无菌PBS冲洗Vero细胞单层三次。加入先前获得的亚环色虫。在每孔补充2%FCS的DMEM中加入10-1的感染或MOI的多重性，并如前所述孵育6小时。

在孵育结束时，用PBS洗涤板两次，并加入100微升不含酚红的DMEM，并补充2%FCS。在DMEM中使Vero细胞悬浮液后，加入每毫升100万个细胞的最终浓度。在T-25烧瓶中的5毫升培养基中接种800， 000个细胞，并孵育过夜以进行细胞粘附。

一旦用PBS冲洗烧瓶，加入锥虫，在五毫升DMEM中加入10-1的MOI，并补充2%FCS，并如前所述孵育过夜。在孵育结束时，用PBS洗涤烧瓶两次。加入5毫升补充2%食品接触物质的新鲜DMEM，孵育四天。

在孵育结束时，在光学显微镜下观察色胺铍突起液的存在后。使用纽鲍尔腔室量化色胺靛。将上清液收集在15毫升管中，并在室温下以7， 000倍G离心10分钟。

然后弃去上清液并将沉淀重悬于DMEM中，不加2%FCS的酚红，以获得每毫升100万色氨酸的浓度。在96孔板中每孔种子100微升色氨酸悬浮液。将苄硝唑溶液加入表观五聚物、具有阽靛的Vero细胞或锥虫鞭毛虫中，如文本手稿中所述。

然后将表观五聚糖孵育，在28摄氏度下放置72小时，并将锥虫或感染的Vero细胞与金刚砂苷在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。对于比色测定，通过加入100微升PBS或相应的培养基来设置空白孔。接下来，向每孔中加入40微升CPRG底物溶液和10微升洗涤剂溶液，以获得最终浓度为200微摩尔CPRG和0.1%洗涤剂，最终体积为250微升。

孵育后，在37摄氏度下孵育两小时，使用微孔板分光光度计测量595纳米处的吸光度。在软件中，通过选择吸光度作为检测方法和终点作为读取类型来创建新协议，然后单击“确定”。接下来，添加读取步骤。

键入所选波长，然后单击确定。在板布局部分标记要读取的孔，单击“确定”，然后单击“读取板”，等待值出现在屏幕上并将其导出到电子表格中以分析结果并使用减法计算吸光度值，如手稿中所述。在统计分析软件中，在XY表中绘制BZN浓度与595纳米处的吸光度的关系。

通过单击“分析”，选择转换选项，然后单击“确定”，将 BZN 浓度转换为对数值。要获取 IC50 值，请单击“分析”，然后从“XY 分析”列表中选择“非线性回归曲线拟合”，然后单击“确定”。接下来，转到参数窗口，在模型选项卡中，转到内置方程的剂量响应抑制组，选择参数的对数抑制剂与响应变量斜率，因为剂量响应方法将所有其他选项卡保留为默认值，然后单击，好的。

单击结果部分以查找 IC50 值、SD 和拟合优度。单击图形部分以查找药物对数浓度与吸光度值的XY图，并确保曲线拟合也以不同的颜色绘制。在本研究中，获得的表观靛的IC50值约为20微摩尔，与以前的研究相似。

此外，结果表明衬剂β半乳糖苷酶随时间推移具有上靛的活性。在卷管理中至少对测试的每个条件进行复制并最小化错误非常重要。