使用CRISPR/Cas9系统将基因挖空直接引入锥虫瘤的肌瘤阶段

在实验中很难使用T.cruzi的宿主感染阶段，因为阿玛斯蒂戈特是细胞内寄生虫的强制。我们的培养技术允许阿玛蒂戈特在宿主细胞外暂时复制，因此我们可以直接在寄生虫的这个临床相关阶段进行实验。演示该程序将是 Yukie Akutsu， 我们研究所的技术人员。

根据手稿指示保持宿主寄生虫共培养。当 Cas9 表达寄生虫准备好分化时，将上流液收集到圆锥管中，并在显微镜下检查样品质量。如果存在大量细胞外海子，则执行游出程序以隔离试管。

将试药和海糖的混合物旋转15分钟，作为2，100倍G.然后丢弃大部分上流液，在管中留下0.5至1毫升的介质。松散地盖住管子，在37摄氏度下孵育颗粒一到两个小时，这将使活性的试药从颗粒中游出。孵育后，将上经剂与试管转移到1.5毫升微离心管中。

向下旋转，用 5 毫升 DMEM 重新暂停颗粒。将寄生虫转移到T-25培养瓶中，在加湿的培养箱中孵化37摄氏度，在5%的二氧化碳下孵化。大约95%的寄生虫在24小时后会分化成食与动物。

将细胞外海子的培养物在2，100倍G下离心15分钟，并丢弃上流液。将颗粒与含有电穿孔缓冲液的颗粒重新填充，最终细胞密度为每毫升10倍至第8个细胞。阿里配额100微升的重新暂停的寄生虫到1.5升微离心管。

然后加入5至10微克的引导RNA，然后通过移液轻轻混合。将混合物转移到两毫米间隙电穿孔盒中，并应用电穿孔装置的脉冲。然后，将蛋瓶内装物转移到含有五毫升预热的 LIT 介质的 T-25 烧瓶中，使瓶盖松动，并在 37 摄氏度下孵育 5%的二氧化碳。

监测细胞生长，要么通过继续轴培养，或在宿主细胞感染后作为细胞内母体。如果监测细胞生长为斧头胺类动物，轻轻摇动烧瓶，将细胞外阿米托酸盐重新放入溶液中，并在微离心管中将培养物的20微升与一微升的碘化氢溶液混合。重要的是，不要将培养瓶留在孵化器之外超过必要的时间，因为温度是导致阿玛底特的斧头增殖的因素之一。

将样品应用到血细胞计上，并在荧光显微镜下观察。然后计算未被碘化丙二烯染色的可行阿米斯特里特的数量。为了监测敲除细胞的生长，作为细胞内海膜，种子宿主3T3细胞在12孔板与DMEM。

电穿孔后一天通过离心收集敲除剂，丢弃上经剂，用两毫升DMEM重新暂停寄生虫。从宿主单元培养中删除介质，并添加重新暂停的主机。在37摄氏度下孵育200万分之二，两天，这将使阿米斯蒂戈特人建立感染。

两天后，用DMEM清洗宿主细胞外的细胞外友爱，并加入新鲜的DMEM。继续孵育两天，然后可视化宿主细胞和细胞内阿米斯特的核。已经证明，与指南RNA对基本基因TcCGM1的T.Cruzi阿米斯特里特与对照组相比，显示出显著的生长缺陷。

当监测细胞内机制的生长时，与T.Cruzi核相关的宿主核在TCCGM1敲解组中比对照组明显较低。相反，Guide RNA对一种副旗杆蛋白TcPAR1的转染在四天的斧头培养后不会显著影响细胞生长，或抑制细胞内寄生。然而，感染后五天，与控制共培养相比，在TcPAR1敲除共培养中，从宿主细胞中产生的试虫数量明显减少。

此外，对照组中宿主单元内的分化试波马提格似乎比淘汰组中的多样试波面罩显得更活跃。此方法还可用于研究外源基因对阿玛斯蒂戈特阶段的影响，而不是将指南RNA转染成Cas9表达的亚马提格，您可以将质粒转染成野生型的阿玛底特，以表达外源基因。