该协议是同类方案中第一个将光敏素应用于活的植入前小鼠胚胎，并考虑在其他3D生理系统上使用光开关药物的用途。光可调光剂允许在空间和时间上操纵微管生长，并转换回关闭状态。在实验之前无意中将光敏素暴露在蓝光下，可能会过早地激活它们。
因此，我们建议您在制备样品时始终在完全黑暗或红光条件下工作。在严格的黑暗条件下，仅使用红光进行照明，开始在超纯水中制作PST-1P的库存和中间工作溶液。如文本手稿中所述。
然后，将PST-1P稀释在新鲜的KSOM中，达到40 M.To 最终浓度，制备用于实时成像的腔室载玻片，在一个孔的中心加入10L PST-1P处理的KSOM，形成半球形液滴。为防止液滴蒸发，请用足够的矿物油覆盖。然后，将准备好的培养皿松散地包裹在铝箔中，或将培养皿置于培养箱中的非气密不透明容器中，以确保没有光照。
将胚胎转移到PST-1P处理的KSOM液滴中后，确保胚胎聚集在液滴的中心，并沉降到培养皿的底部。制备浸入式物镜后，将腔室载玻片安装在显微镜上，置于环境室内。设定在37°C和5%CO2，并在完全黑暗中，以确保所有PST-1P都处于非活性反式配置中，并且胚胎可以沉入培养皿的底部。
使用红光手电筒定位与浸入介质接触的物镜。然后，找到培养基液滴的边缘，并将物镜直接定位在其上方。使用实时扫描模式和561nm激光器，定位液滴内的胚胎。
使用阶段控制器和实时扫描模式设置起点和终点，以获取整个胚胎的z-stack。根据您的信号将激光功率设置调整到最大5%。并根据您的信号将数字偏移设置为最大值0.900，以优化EB3-dTomato彗星的外观。
最大限度地减少背景噪音。将针孔设置为2 m。像素分辨率为 512 x 512。
像素停留时间为3.15秒。并将缩放设置为 2 倍。以1 m的切片间隔获取整个胚胎的z堆栈，以评估整个生物体中微管生长的区域。
对于EB3-dTomato彗星跟踪实验，打开3D z-stack图像，将缩放增加到三倍。并在感兴趣的特定亚细胞区域周围绘制一个矩形ROI。然后，使用设置的参数获取单个z平面的延时短片，时间间隔为500 ms。
要激活PST-1P，切换到405 nm激光器，并获取另一个延时，激光设置为10%功率，针孔打开最大，像素分辨率为512×512，像素停留时间为3.15 s，变焦为3倍，时间间隔为500 ms，并设置20帧进行采集。激活后立即切换回561nm激光，并重复采集，如前所述，以确认PST-1P激活后EB3-dTomato彗星的丢失。现在，要将PST-1P反转回其非活动转相状态，请接合514 nm激光器，并使用设置参数获取另一个延时摄影。
为了可视化EB3-dTomato彗星的恢复，请切换回561 nm激光，并重复采集。在未经处理的对照胚胎中，在用405nm激光照射之前，EB3-dTomato信号在细胞的整个细胞质中很高，除了核区域。照明后，未检测到信号的变化。
表明405nm激光不会对胚胎或微管动力学造成光损伤。在PST-1P处理16细胞期胚胎期间，在严格的黑暗条件下，在3D图像中检测到较强的EB3-dTomato表达，表明无活性PST-1P在黑暗条件下未引起微管聚合的抑制。在PST-1P激活之前，单个z平面的延时成像证实了较强的EB3-dTomato表达，并且在亚细胞区域中微管聚合。
在405nm光激活后，在几秒钟内，检测到EB3-d番茄彗星信号的减少。信号的恢复是在PST-1P失活时使用514 nm激光器实现的。微量注射EB3-dTomato，与PST-1P一起孵育的胚胎显示出正常的胚胎潜力，发育到囊胚阶段。
有丝分裂期间微管动力学正常。表明活性PST-1P对胚胎无毒性。在获得的延时电影中，EB3-dTomato标记显示为彗星样结构，并能够跟踪生长中的微管丝。
在PST-1P处理的胚胎中，保持在黑暗条件下，单个EB3-dTomato彗星从相间桥发出，该桥充当早期小鼠胚胎中的非中心体微管组织中心。T-堆栈显示EB3-d番茄彗星在相间桥区域。在PST-1P激活后，EB3-d番茄彗星在相间桥的底部和t-堆叠中减少。
请记住，白光会过早激活PST-1P。因此，仅使用红光源即可获得可见性。绿光也会使PST-1P失活，因此请避免使用绿色荧光标签标记。
该技术已用于果蝇，变形虫，小鼠和多种体外系统，以靶向微管生长，以研究细胞迁移和组织形成。
