פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו ליישם photostatins על עובר עכבר טרום ההשתלה חי, ולשקול שימושים לשימוש בסמים הניתנים למיתוג אור במערכות פיזיולוגיות 3D אחרות. פוטוסטטינים הניתנים להחלפה באור מאפשרים מניפולציה של צמיחת מיקרוטובולה, במרחב ובזמן, ולהמיר בחזרה למצב כבוי. חשיפה לא מכוונת של פוטוסטטינים לאור כחול, לפני הניסוי, יכולה להפעיל אותם בטרם עת.
לכן אנו ממליצים לעבוד בחושך מוחלט, או בתנאי אור אדום, בכל עת בעת הכנת הדגימות שלך. בתנאים כהים קפדניים, באמצעות אור אדום בלבד לתאורה, להתחיל לעשות מלאי ופתרון עבודה ביניים של PST-1P במים אולטרה-פור. כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט.
לאחר מכן, לדלל PST-1P ב KSOM טרי כדי להשיג את הריכוז הסופי של 40 M.To להכין את שקופית החדר להדמיה חיה, להוסיף 10 L של PST-1P מטופל KSOM למרכז של באר אחת, כדי ליצור טיפה חצי כדורית. כדי למנוע מהטיפה להתאדות, כסו אותה בשמן מינרלי מספיק. לאחר מכן, לעטוף באופן רופף את צלחת התרבות מוכנה בנייר כסף, או למקם את צלחת התרבות במיכל אטום לא אטום בחממה כדי להבטיח שאין חשיפה לאור.
לאחר העברת העוברים לתוך PST-1P שטופלו KSOM טיפה, להבטיח כי העוברים מקובצים במרכז הטיפה, והתיישבו לתחתית המנה. לאחר הכנת עדשת המטרה של הטבילה, הר את שקופית התא על המיקרוסקופ, בתוך תא סביבתי. מוגדר ב 37 C ו 5%CO2, ובחשיכה מוחלטת, כדי להבטיח את כל PST-1Ps נמצאים בתצורה טרנס לא פעילה, וכי עוברים יכולים לשקוע לתחתית המנה.
השתמש לפיד אור אדום כדי למקם את העדשה האובייקטיבית במגע עם מדיום הטבילה. לאחר מכן, לאתר את הקצה של טיפת המדיום ולמקם את המטרה ישירות מעליו. באמצעות מצב סריקה חיה, ולייזר 561 ננומטר, אתר את העוברים בתוך הטיפה.
השתמש בבקרי במה ובמצב סריקה חיה כדי להגדיר את נקודות ההתחלה והסיום לרכישת ערימת z של העובר כולו. כוונן את הגדרות צריכת החשמל של הלייזר עד למקסימום של 5% בהתאם לאות שלך. והגדר את ההיסט הדיגיטלי למקסימום של 0.900, על פי האות שלך, כדי לייעל את המראה של כוכבי השביט EB3-dTomato.
מזער את רעשי הרקע. כוון את חור הסיכה ל-2 מ'. רזולוציית פיקסלים ב-512 על 512.
וזמן ההשתהות של הפיקסלים הוא 3.15 שניות. ולהגדיר את הזום ל 2x. לרכוש z-מחסנית של העובר כולו עם מרווחי סעיף 1 מ 'כדי להעריך את האזורים של צמיחת microtubule באורגניזם כולו.
לניסויי מעקב אחר כוכבי שביט EB3-dTomato, פתחו את התמונה התלת-ממדית z-stack והגדילו את הזום לשלוש פעמים. ולצייר החזר מלבני סביב האזור התת-תאי הספציפי של עניין. לאחר מכן, לרכוש את הסרט לשגות זמן של מישור z יחיד, באמצעות הפרמטרים שנקבעו, עם מרווח הזמן של 500 אלפיות השנייה.
כדי להפעיל PST-1P, לעבור לייזר 405 ננומטר, ולרכוש עוד זמן לשגות, עם לייזר להגדיר 10% כוח, חור סיכה נפתח מקסימום, רזולוציית פיקסלים של 512 על ידי 512 על 512, זמן השתהות פיקסל של 3.15 שניות, זום של שלוש פעמים, במרווח זמן של 500 ms, ולהגדיר 20 מסגרות לרכישה. מיד לאחר ההפעלה, חזור ללייזר 561 ננומטר, וחזור על הרכישה, כפי שהוכח בעבר, כדי לאשר את אובדן כוכבי השביט EB3-dTomato לאחר ההפעלה של PST-1P. עכשיו, כדי להפוך PST-1P בחזרה למצב הטרנס לא פעיל שלה, לעסוק לייזר 514 ננומטר, ולרכוש עוד זמן לשגות עם פרמטרים מוגדרים.
כדי לדמיין את ההתאוששות של כוכבי שביט EB3-dTomato, חזור ללייזר 561 ננומטר וחזור על הרכישה. בעוברי בקרה לא מטופלים, לפני הארה עם לייזר 405 ננומטר, אות EB3-dTomato היה גבוה בתוך כל הציטופלסמה של התא, למעט האזור הגרעיני. תאורת פוסט, שינויים באות לא זוהו.
מה שמצביע על כך שלייזר 405 ננומטר לא גרם נזק לצילום לדינמיקת העובר או המיקרוטובולה. במהלך טיפול PST-1P של עוברים שלב 16 תאים, בתנאים כהים קפדניים, ביטוי EB3-dTomato חזק זוהה בתמונה 3D, מדגים כי PST-1P לא פעיל לא לעורר עיכוב של פילמור microtubule בתנאים כהים. לפני ההפעלה של PST-1P, הדמיית זמן לשגות של מטוס z יחיד אישר ביטוי חזק EB3-dTomato, פילמור microtubule באזור תת-תאי.
לאחר הפעלת אור 405 ננומטר, בתוך שניות, זוהתה ירידה באות השביט EB3-dTomato. והתאוששות של האות הושגה עם ביטול של PST-1P, באמצעות לייזר 514 ננומטר. מיקרו העוברים מוזרק עם EB3-dTomato, ודגר עם PST-1P, הראה פוטנציאל עוברי נורמלי, פיתוח לשלב blastocyst.
ודינמיקה מיקרוטובולית רגילה במהלך מיטוזה. המציין אי רעילות של PST-1P פעיל לעובר. בסרטים שנרכשו בזמן לשגות, EB3-dTomato תיוג הופיע כמבנים דמויי כוכב שביט, ואיפשר מעקב אחר חוטי microtubule גדלים.
בעוברים שטופלו ב- PST-1P, שנשמרו בתנאים כהים, כוכבי שביט בודדים מסוג EB3-dTomato נבעו מגשר אינטרפאזה, הפועל כמרכז ארגון מיקרוטובולה לא-צנטרוסומלית בעובר העכבר המוקדם. t-stack מציג כוכבי שביט EB3-dTomato באזור הגשר הבין-פאזי. לאחר ההפעלה של PST-1P, כוכבי שביט EB3-dTomato צומצמו בבסיס הגשר הבין-פאזי ובערימת t.
זכור כי אור לבן יכול להפעיל PST-1P בטרם עת. אז השתמש רק במקורות אור אדום לנראות. אור ירוק גם מנטרל PST-1P, אז בבקשה להימנע משימוש סמני תווית פלואורסצנטית ירוקה.
טכניקה זו שימשה drosophila, אמבה, עכברים, ומערכות הפריה חוץ גופית מרובות, כדי למקד צמיחה microtubule על מנת ללמוד נדידת תאים היווצרות רקמות.
