Ce protocole est le premier du genre à appliquer des photostatines sur l’embryon de souris préimplantatoire vivant et à envisager des utilisations pour utiliser des médicaments commutables à la lumière sur d’autres systèmes physiologiques 3D. Les photostatines commutables à la lumière permettent de manipuler la croissance des microtubules, dans l’espace et le temps, et d’être reconverties à un état éteint. L’exposition involontaire de photostatines à la lumière bleue, avant l’expérience, peut les activer prématurément.
Nous vous conseillons donc de travailler dans l’obscurité totale, ou dans des conditions de lumière rouge, à tout moment lors de la préparation de vos échantillons. Dans des conditions d’obscurité strictes, en utilisant uniquement la lumière rouge pour l’éclairage, commencez à fabriquer une solution de travail de stock et intermédiaire de PST-1P dans de l’eau ultrapure. Comme décrit dans le manuscrit du texte.
Ensuite, diluez PST-1P dans du KSOM frais pour atteindre la concentration finale de 40 M.To préparez la lame de chambre pour l’imagerie en direct, ajoutez 10 L de KSOM traité par PST-1P au centre d’un puits, pour former une gouttelette hémisphérique. Pour éviter que la gouttelette ne s’évapore, couvrez-la avec suffisamment d’huile minérale. Ensuite, enveloppez lâchement le plat de culture préparé dans du papier d’aluminium ou placez le plat de culture dans un récipient opaque non hermétique dans l’incubateur pour éviter toute exposition à la lumière.
Après avoir transféré les embryons dans la goutte KSOM traitée par PST-1P, assurez-vous que les embryons sont regroupés au centre de la gouttelette et déposés au fond du plat. Une fois la lentille de l’objectif d’immersion préparée, montez la lame de la chambre sur le microscope, à l’intérieur d’une chambre environnementale. Réglez à 37 ° C et 5% de CO2, et dans l’obscurité totale, pour vous assurer que tous les PST-1P sont dans la configuration trans inactive et que les embryons peuvent couler au fond de la boîte.
Utilisez une torche à lumière rouge pour positionner l’objectif en contact avec le milieu d’immersion. Ensuite, localisez le bord de la gouttelette du milieu et positionnez l’objectif directement au-dessus. À l’aide du mode de balayage en direct et d’un laser de 561 nm, localisez les embryons dans la gouttelette.
Utilisez des contrôleurs de scène et le mode de balayage en direct pour définir les points de départ et d’arrivée de l’acquisition d’une pile z de l’embryon entier. Ajustez les paramètres de puissance laser jusqu’à un maximum de 5% en fonction de votre signal. Et réglez le décalage numérique à un maximum de 0,900, selon votre signal, pour optimiser l’apparence des comètes EB3-dTomato.
Minimisez le bruit de fond. Réglez le sténopé à 2 m. Résolution des pixels à 512 par 512.
Et le temps de séjour du pixel à 3,15 s. Et réglez le zoom sur 2x. Acquérir une pile z de l’embryon entier avec des intervalles de section de 1 m pour évaluer les zones de croissance des microtubules dans l’organisme entier.
Pour les expériences de suivi de comète EB3-dTomato, ouvrez l’image 3D z-stack, augmentez le zoom à trois fois. Et dessinez un retour sur investissement rectangulaire autour de la zone subcellulaire spécifique d’intérêt. Ensuite, acquérez le film en accéléré d’un seul plan z, en utilisant les paramètres définis, avec un intervalle de temps de 500 ms.
Pour activer PST-1P, passez à un laser 405 nm et acquérez un autre time-lapse, avec le laser réglé sur 10% de puissance, le sténopé s’ouvre au maximum, la résolution en pixels de 512 par 512, le temps de séjour en pixels de 3,15 s, zoomez trois fois, à un intervalle de temps de 500 ms et définissez 20 images à acquérir. Immédiatement après l’activation, revenez au laser 561 nm et répétez l’acquisition, comme démontré précédemment, pour confirmer la perte de comètes EB3-dTomato après l’activation de PST-1P. Maintenant, pour inverser PST-1P à son état trans inactif, engagez un laser 514 nm et acquérez un autre time-lapse avec des paramètres définis.
Pour visualiser la récupération des comètes EB3-dTomato, revenez au laser 561 nm et répétez l’acquisition. Chez les embryons témoins non traités, avant l’illumination avec un laser de 405 nm, le signal EB3-dTomato était élevé dans l’ensemble du cytoplasme de la cellule, à l’exception de la zone nucléaire. Après l’éclairage, les changements dans le signal n’ont pas été détectés.
Indiquant que le laser 405 nm n’a pas causé de dommages photo à l’embryon ou à la dynamique des microtubules. Au cours du traitement PST-1P d’embryons au stade 16 cellules, dans des conditions d’obscurité strictes, une forte expression d’EB3-dTomato a été détectée dans l’image 3D, démontrant que pst-1P inactif n’a pas provoqué d’inhibition de la polymérisation des microtubules dans des conditions sombres. Avant l’activation de PST-1P, l’imagerie en accéléré d’un seul plan z a confirmé une forte expression d’EB3-dTomato et une polymérisation de microtubules dans une région subcellulaire.
Après une activation de la lumière de 405 nm, en quelques secondes, une réduction du signal de la comète EB3-dTomato a été détectée. Et la récupération du signal a été réalisée lors de la désactivation de PST-1P, à l’aide d’un laser de 514 nm. Les embryons micro-injectés avec EB3-dTomato, et incubés avec PST-1P, ont montré un potentiel embryonnaire normal, se développant au stade de blastocyste.
Et la dynamique normale des microtubules pendant la mitose. Indiquant la non-toxicité d’un PST-1P actif pour l’embryon. Dans les films en accéléré acquis, le marquage EB3-dTomato est apparu comme des structures ressemblant à des comètes et a permis de suivre les filaments de microtubules en croissance.
Dans les embryons traités par PST-1P, maintenus dans des conditions sombres, des comètes EB3-dTomato individuelles émanaient du pont interphasique, qui agit comme un centre organisateur de microtubules non centrosomiques dans l’embryon de souris précoce. Une pile en T montre des comètes EB3-dTomato dans la région du pont interphasique. Après l’activation de PST-1P, les comètes EB3-dTomato ont été réduites à la base du pont interphasé et dans la pile en T.
Rappelez-vous que la lumière blanche peut activer PST-1P prématurément. Utilisez donc uniquement des sources de lumière rouge pour la visibilité. Le voyant vert désactive également PST-1P, veuillez donc éviter d’utiliser des marqueurs d’étiquettes fluorescentes vertes.
Cette technique a été utilisée chez la drosophile, l’amibe, la souris et de multiples systèmes in vitro, pour cibler la croissance des microtubules afin d’étudier la migration cellulaire et la formation de tissus.
