Este protocolo é o primeiro de seu tipo a aplicar fotostatinas no embrião de camundongos pré-implantação vivo, e considerar usos para usar drogas comutação leve em outros sistemas fisiológicos 3D. Fotostatinas comutação de luz permitem a manipulação do crescimento de microtúbulos, no espaço e no tempo, e são convertidas de volta para um estado fora. Expor involuntariamente fotostatinas à luz azul, antes do experimento, pode ativá-las prematuramente.
Por isso, aconselhamos trabalhar em completa escuridão, ou condições de luz vermelha, o tempo todo ao preparar suas amostras. Em condições escuras estritas, utilizando apenas luz vermelha para iluminação, comece a fazer estoque e solução de trabalho intermediária de PST-1P em água ultrapura. Como descrito no manuscrito do texto.
Em seguida, diluir PST-1P em KSOM fresco para alcançar a concentração final de 40 M.To preparar o slide de câmara para imagens ao vivo, adicionar 10 L de KSOM tratado PST-1P no centro de um poço, para formar uma gotícula hemisférica. Para evitar que a gotícula evapore, cubra-a com óleo mineral suficiente. Em seguida, enrole livremente o prato de cultura preparado em papel alumínio, ou coloque o prato de cultura em um recipiente opaco não hermético na incubadora para garantir que não haja exposição à luz.
Depois de transferir os embriões para a queda de KSOM tratada pelo PST-1P, certifique-se de que os embriões estão agrupados no centro da gotícula e acomodados no fundo do prato. Uma vez que a lente objetiva de imersão é preparada, monte o deslizamento da câmara no microscópio, dentro de uma câmara ambiental. Definido em 37 C e 5% de CO2, e em completa escuridão, para garantir que todos os PST-1Ps estejam na configuração transaativa inativa, e que os embriões possam afundar até o fundo do prato.
Use uma tocha de luz vermelha para posicionar a lente objetiva em contato com o meio de imersão. Em seguida, localize a borda da gota do meio e posicione o objetivo diretamente sobre ele. Usando o modo de varredura ao vivo, e um laser de 561 nm, localize os embriões dentro da gotícula.
Use controladores de palco e modo de digitalização ao vivo para definir os pontos de partida e fim para adquirir uma pilha z de todo o embrião. Ajuste as configurações de alimentação a laser até um máximo de 5% de acordo com o seu sinal. E defina deslocamento digital para um máximo de 0,900, de acordo com o seu sinal, para otimizar a aparência dos cometas EB3-dTomato.
Minimize o ruído de fundo. Coloque o orifício em 2 m. Resolução do pixel em 512 por 512.
E o tempo de pixels em 3.15 s. E defina o zoom em 2x. Adquira uma pilha z de todo o embrião com intervalos de seção de 1 m para avaliar as áreas de crescimento de microtúbulos em todo o organismo.
Para experimentos de rastreamento de cometas EB3-dTomato, abra a imagem 3D z-stack, aumente o zoom para três vezes. E desenhe um ROI retangular em torno da área subcelular específica de interesse. Em seguida, adquira o filme de lapso de tempo de um único z-plane, usando os parâmetros definidos, com o intervalo de tempo de 500 ms.
Para ativar o PST-1P, mude para um laser de 405 nm e adquira outro lapso de tempo, com o conjunto laser a 10% de potência, o pinhole aberto no máximo, resolução de pixels de 512 por 512, o tempo de 3,15 s, zoom de três vezes, em um intervalo de tempo de 500 ms, e definir 20 quadros a serem adquiridos. Imediatamente após a ativação, mude de volta para laser de 561 nm, e repita a aquisição, como demonstrado anteriormente, para confirmar a perda de cometas EB3-dTomato após a ativação do PST-1P. Agora, para reverter o PST-1P de volta ao seu trans-estado inativos, engaje um laser de 514 nm e adquira outro lapso de tempo com parâmetros definidos.
Para visualizar a recuperação dos cometas EB3-dTomato, mude de volta para laser de 561 nm e repita a aquisição. Em embriões de controle não tratados, antes da iluminação com um laser de 405 nm, o sinal EB3-dTomato era alto dentro de todo o citoplasma da célula, exceto a área nuclear. Após a iluminação, não foram detectadas alterações no sinal.
Indicando que o laser de 405 nm não causou danos fotográficos à dinâmica do embrião ou microtúbulo. Durante o tratamento PST-1P de embriões em estágio de 16 células, sob estritas condições escuras, foi detectada forte expressão EB3-dTomato na imagem 3D, demonstrando que o PST-1P inativo não provocou inibição da polimerização de microtúbulos em condições escuras. Antes da ativação do PST-1P, a imagem de lapso de tempo de um único z-plane confirmou forte expressão EB3-dTomato e polimerização microtúbula em uma região subcelular.
Após a ativação da luz de 405 nm, em segundos, foi detectada uma redução no sinal do cometa EB3-dTomato. E a recuperação do sinal foi alcançada após a desativação do PST-1P, usando um laser de 514 nm. Os embriões micro injetados com EB3-dTomato, e incubados com PST-1P, mostraram potencial embrionário normal, desenvolvendo-se para o estágio blastocisto.
E dinâmica normal de microtúbulos durante a mitose. Indicando a não toxicidade de um PST-1P ativo para o embrião. Nos filmes adquiridos de lapso de tempo, a rotulagem EB3-dTomato apareceu como estruturas semelhantes a cometas, e permitiu o rastreamento de filamentos microtúbulos crescentes.
Em embriões tratados PST-1P, mantidos em condições escuras, cometas individuais EB3-dTomato emanados da ponte interfase, que funciona como um centro organizador de microtúbulos não-centrosoômicos no embrião inicial do rato. Uma pilha de t mostra cometas EB3-dTomato na região da ponte interfase. Após a ativação do PST-1P, os cometas EB3-dTomato foram reduzidos na base da ponte interfásica e na pilha t.
Lembre-se que a luz branca pode ativar PST-1P prematuramente. Então use apenas fontes de luz vermelha para visibilidade. A luz verde também desativa PST-1P, por isso evite usar marcadores de rótulo fluorescentes verdes.
Esta técnica tem sido usada em drosophila, ameba, camundongos e múltiplos sistemas in vitro, para direcionar o crescimento de microtúbulos a fim de estudar a migração celular e a formação de tecidos.
