Este protocolo es el primero de su tipo en aplicar fotostatinas en el embrión de ratón vivo preimplantacional, y considera que utiliza el uso de medicamentos conmutables por luz en otros sistemas fisiológicos 3D. Las fotostatinas conmutables por luz permiten la manipulación del crecimiento de microtúbulos, en el espacio y el tiempo, y se convierten de nuevo a un estado apagado. Exponer involuntariamente las fotostatinas a la luz azul, antes del experimento, puede activarlas prematuramente.
Por eso aconsejamos trabajar en completa oscuridad, o en condiciones de luz roja, en todo momento a la hora de preparar tus muestras. En condiciones estrictas de oscuridad, utilizando solo luz roja para la iluminación, comience a hacer una solución de trabajo intermedia y de stock de PST-1P en agua ultrapura. Como se describe en el texto manuscrito.
Luego, diluya PST-1P en KSOM fresco para lograr la concentración final de 40 M.To prepare la diapositiva de la cámara para imágenes en vivo, agregue 10 L de KSOM tratado con PST-1P en el centro de un pozo, para formar una gota hemisférica. Para evitar que la gota se evapore, cúbrala con suficiente aceite mineral. Luego, envuelva libremente el plato de cultivo preparado en papel de aluminio, o coloque el plato de cultivo en un recipiente opaco no hermético en la incubadora para garantizar que no haya exposición a la luz.
Después de transferir los embriones a la gota de KSOM tratada con PST-1P, asegúrese de que los embriones se agrupen en el centro de la gota y se asienten en el fondo del plato. Una vez preparada la lente del objetivo de inmersión, monte el portaobjetos de la cámara en el microscopio, dentro de una cámara ambiental. Establecido en 37 C y 5% de CO2, y en completa oscuridad, para garantizar que todos los PST-1P estén en la transconfiguración inactiva, y que los embriones puedan hundirse en el fondo del plato.
Utilice una antorcha de luz roja para colocar la lente del objetivo en contacto con el medio de inmersión. Luego, ubique el borde de la gota del medio y coloque el objetivo directamente sobre él. Usando el modo de escaneo en vivo y un láser de 561 nm, localice los embriones dentro de la gota.
Utilice controladores de etapa y el modo de escaneo en vivo para establecer los puntos de inicio y final para adquirir una pila z de todo el embrión. Ajuste la configuración de potencia del láser hasta un máximo del 5% de acuerdo con su señal. Y ajuste el desplazamiento digital a un máximo de 0.900, de acuerdo con su señal, para optimizar la apariencia de los cometas EB3-dTomato.
Minimizar el ruido de fondo. Coloque el agujero de alfiler a 2 m. Resolución de píxeles a 512 por 512.
Y el tiempo de permanencia de píxeles en 3.15 s. Y ajuste el zoom a 2x. Adquirir una pila z de todo el embrión con intervalos de sección de 1 m para evaluar las áreas de crecimiento de microtúbulos en todo el organismo.
Para los experimentos de seguimiento de cometas EB3-dTomato, abra la imagen 3D z-stack, aumente el zoom a tres veces. Y dibuje un ROI rectangular alrededor del área subcelular específica de interés. Luego, adquiera la película de lapso de tiempo de un solo plano z, utilizando los parámetros establecidos, con el intervalo de tiempo de 500 ms.
Para activar PST-1P, cambie a un láser de 405 nm y adquiera otro lapso de tiempo, con el láser configurado al 10% de potencia, estenopeico abierto al máximo, resolución de píxeles de 512 por 512, el tiempo de permanencia de píxeles de 3.15 s, zoom de tres veces, en un intervalo de tiempo de 500 ms y configure 20 cuadros para adquirir. Inmediatamente después de la activación, vuelva a cambiar al láser de 561 nm y repita la adquisición, como se demostró anteriormente, para confirmar la pérdida de cometas EB3-dTomato después de la activación de PST-1P. Ahora, para revertir PST-1P a su transestado inactivo, active un láser de 514 nm y adquiera otro lapso de tiempo con parámetros establecidos.
Para visualizar la recuperación de los cometas EB3-dTomato, vuelva a cambiar al láser de 561 nm y repita la adquisición. En embriones de control no tratados, antes de la iluminación con un láser de 405 nm, la señal EB3-dTomato era alta dentro de todo el citoplasma de la célula, excepto el área nuclear. Después de la iluminación, no se detectaron cambios en la señal.
Indicando que el láser de 405 nm no causó daño fotográfico a la dinámica embrionaria o de microtúbulos. Durante el tratamiento PST-1P de embriones en etapa de 16 células, bajo estrictas condiciones oscuras, se detectó una fuerte expresión de EB3-dTomato en la imagen 3D, lo que demuestra que pst-1P inactivo no provocó la inhibición de la polimerización de microtúbulos en condiciones oscuras. Antes de la activación de PST-1P, la imagen de lapso de tiempo de un solo plano z confirmó una fuerte expresión de EB3-dTomato y polimerización de microtúbulos en una región subcelular.
Después de la activación de la luz de 405 nm, en cuestión de segundos, se detectó una reducción en la señal del cometa EB3-dTomato. Y la recuperación de la señal se logró tras la desactivación de PST-1P, utilizando un láser de 514 nm. Los embriones micro inyectados con EB3-dTomato, e incubados con PST-1P, mostraron un potencial embrionario normal, desarrollándose hasta la etapa de blastocisto.
Y la dinámica normal de los microtúbulos durante la mitosis. Indicando no toxicidad de un PST-1P activo para el embrión. En las películas de lapso de tiempo adquiridas, el etiquetado EB3-dTomato apareció como estructuras similares a cometas y permitió el seguimiento de filamentos de microtúbulos en crecimiento.
En embriones tratados con PST-1P, mantenidos en condiciones de oscuridad, los cometas EB3-dTomato individuales emanaron del puente interfase, que actúa como un centro organizador de microtúbulos no centrosómicos en el embrión de ratón temprano. Una pila en T muestra cometas EB3-dTomato en la región del puente interfase. Tras la activación de PST-1P, los cometas EB3-dTomato se redujeron en la base del puente interfase y en la pila en T.
Recuerde que la luz blanca puede activar PST-1P prematuramente. Por lo tanto, use solo fuentes de luz roja para la visibilidad. La luz verde también desactiva PST-1P, así que evite usar marcadores de etiquetas fluorescentes verdes.
Esta técnica se ha utilizado en drosophila, ameba, ratones y múltiples sistemas in vitro, para atacar el crecimiento de microtúbulos con el fin de estudiar la migración celular y la formación de tejidos.
