荧光蛋白中脯氨酸类似物对脯氨酸的残基特异换:骨架的"分子手术"如何影响折叠和稳定性

在大多数情况下，传统的定点诱变不适合研究脯氨酸在蛋白质中的功能作用。在这里，我们提出了一种将脯氨酸类似物作为非规范氨基酸掺入核糖体合成蛋白质中的方法，以研究脯氨酸残基对蛋白质折叠和功能的作用。用标准氨基酸取代脯氨酸是一种危险的方法。

掺入脯氨酸类似物允许一种分子手术。换句话说，它引入了微妙的分子变化，以合理地影响和操纵蛋白质特性。由于脯氨酸残基在蛋白质支架的稳定性中起着至关重要的作用，我们的技术可能有助于了解蛋白质折叠缺陷背后的原因，这是人类某些病理状态的基础。

脯氨酸替代诱导的蛋白质改变对酶的生物技术工程具有重要意义，并为增强核糖体蛋白质翻译或折叠提供了机会。这种方法不需要特殊的设备和昂贵的仪器仪表。应特别注意方案步骤，其中在添加脯氨酸类似物之前从大肠杆菌培养物中耗尽天然脯氨酸。

要开始用天然脯氨酸生产荧光蛋白，请在装有两毫升过夜培养物的两升锥形瓶中接种200毫升新鲜NMM培养基。将细胞在37摄氏度下以220 RPM的轨道振荡器孵育约3.5小时。在孵育过程中，每30分钟在分光光度计中测量600纳米的光密度。

当光密度达到0.7时，旋转下细胞悬浮液并轻轻地将上清液倾析成废物。然后，通过重悬于50毫升不含任何氨基酸的冰冷NMM或不含脯氨酸的NMM来洗涤细胞。再次旋转细胞并将上清液倾析成废物。

接下来，通过在200毫升不含脯氨酸的NMM中轻柔移液并在两升锥形瓶中补充氨苄青霉素来重悬细胞沉淀，并将细胞在眼眶振荡器中孵育30分钟，以允许脯氨酸完全耗尽。孵育后，从50毫摩尔储备溶液中加入适当体积的L-脯氨酸或脯氨酸类似物，以获得细胞悬浮液中的一毫摩尔终浓度。接下来，通过从单摩尔储备溶液中加入500微摩尔IPTG来诱导靶蛋白表达。

在轨道振荡器中以37摄氏度表达目标蛋白质过夜，并在第二天测量光密度。通过离心收集细菌细胞，并将上清液倾析成废物。然后，通过在含有10%甘油的50毫升结合缓冲液中小心移液来洗涤细胞。

再次旋转细胞，倾析上清液，并将细胞沉淀以零下20或80摄氏度储存在50毫升管中，直到进一步使用。在评估荧光发射之前，执行SDS-PAGE以确保样品纯度高于95%，然后将每个纯化的蛋白质变体的样品调整为0.3微摩尔的浓度，以适当波长处的计算吸光度值作为参考。确保近似的最终样品体积为200微升。

让稀释的样品在室温下平衡。一小时后，将样品转移到一厘米的石英比色皿中，并使用荧光光谱仪测量样品的荧光发射光谱。为了诱导变性，通过将两微升300微摩尔样品加入18微升含有8.89摩尔尿素和5.56毫摩尔DTT的1.11X PBS缓冲液中，将每种蛋白质变体的样品稀释20倍。

将样品在95摄氏度下孵育5分钟。然后，通过加入1， 980微升含有5毫摩尔DTT的PBS来稀释样品100倍以诱导再饱和，并立即将200微升样品转移到一厘米石英比色皿中。将石英比色皿插入适当的荧光光谱仪，并通过在30分钟内每三秒获取一次荧光光谱来监测蛋白质重折叠。

将重新折叠的样品转移到1.5毫升微量离心管中，然后关闭盖子并将样品在室温下储存在黑暗中，以允许EGFP变体的完全重新折叠。24小时后，使用与以前相同的激发波长测量重折叠蛋白质样品的荧光发射，以捕获荧光恢复的时间终点。来自表达天然蛋白的细胞的沉淀以及含有S-氟脯氨酸和脱氢脯氨酸的变体由于发色团完整，具有典型的鲜艳颜色。

相比之下，含有R-氟脯氨酸和二氟脯氨酸的变体保持无色，表明未折叠的蛋白质在包涵体中错误折叠和沉积。SDS-PAGE分析验证了含R-氟脯氨酸的不溶性蛋白质的存在。相比之下，在可溶性馏分中发现了天然蛋白和S-氟脯氨酸和含有脱氢脯氨酸的变体。

在液相色谱/质谱分析中，每个用S-氟脯氨酸替代脯氨酸产生每个脯氨酸的正18道尔顿位移，而用脱氢脯氨酸替代产生每个残留物两个道尔顿的负位移。在光吸收和发射光谱中，EGFP的发色团吸光度为488纳米，NowGFP的发色团吸光度为493纳米。在KillerOrange中，发色团吸光度区域由两个条带组成，对应于复合发色团的两种可能的构型和电荷状态。

此外，在相应的最大吸光度波长下激发时记录的荧光光谱意味着类似物不会改变发色团的化学环境。在重折叠实验中，天然EGFP发色团荧光部分恢复，尽管色氨酸特异性荧光在复性后更大。对于含有脱氢脯氨酸的变体，观察到类似的行为。

在含有EGFP的S-氟脯氨酸中，用295纳米的激发观察到类似的结果，而荧光在488纳米处恢复到更高的程度。只有EGFP变体显示出快速的重折叠动力学，色氨酸发射回收率是发色团发射的两倍。必须使用具有合适生长培养基的新鲜细菌培养物。

无菌技术和定期监测培养生长也是实验成功的重要先决条件。这种方法适用于蛋白质工程，因为它可以研究其他规范氨基酸的作用。为此，需要合适的自养性大肠杆菌菌株和氨基酸类似物。

需要全蛋白的质谱作为分析证据来确认非规范氨基酸类似物的掺入。掺入脯氨酸类似物的SPI方法使我们能够直接操纵蛋白质主链，并通过全局稳定和改善核糖体翻译或折叠，为合理设计和促进蛋白质生产提供了优势。