巨型单层囊泡内重组细胞骨架的快速封装

近年来，在细胞大小的脂质双层囊泡内包封已被证明是体外重建实验的有用方法。我们提出的方法将极大地帮助合成细胞研究中的细胞骨架重构。通过这种方法，我们可以产生具有高产量的异质大小的巨型单层囊泡。

与传统的cDICE技术相比，囊泡生成时间显着减少。我们可以封装从复杂的，同时发生的细胞过程中分离出来的无细胞转录翻译系统，以检查分子途径。这种方法可以用来组装最小的原始细胞，以创建功能合成细胞。

通过将二油酰基磷酸胆碱，胆固醇和罗丹明PE转移到15毫升玻璃瓶中，开始制备油脂混合物。然后，在小瓶中加入0.5毫升氯仿。将7.2毫升硅油和1.8毫升矿物油移入单独的15毫升管中，并以每分钟3， 200转的速度涡旋混合油10秒。

然后，将油混合物加入含有脂质和氯仿混合物的小瓶中，并以每分钟3，200旋转的速度涡旋混合物，持续10至15秒，直到所得的脂质混合物略带浑浊，因为脂质未完全溶解在油中。接下来，在室温下，在具有80瓦超声波功率和40千赫兹工作频率的浴式超声处理器中超声处理油分散体中的脂质30分钟。如果不立即使用，请将脂油混合物储存在4摄氏度下24小时。

要生成囊泡，请使用由黑色树脂制成的3D打印轴的组件，该轴以每分钟1， 200转的速度安装在台式搅拌板上。然后，将3D打印的连续液滴界面交叉封装或cDICE室，由透明树脂制成，安装在黑色树脂轴上。在球状肌动蛋白缓冲液或G缓冲液中制备1至10微摩尔肌动蛋白溶液，包括10%ATO 488肌动蛋白。

要开始肌动蛋白聚合，在冰上的肌动蛋白溶液中加入丝状肌动蛋白聚合缓冲液或F缓冲液，然后将溶液保持在冰上以减缓肌动蛋白聚合，然后再加入交联剂。为了制备肌动蛋白结合蛋白或ABP，从每毫升1.75毫克的筋膜储备中，在单独的微管中等分1.57微升的筋膜。接下来，在肌动蛋白溶液中加入7.5%的密度梯度介质，在外水相和内水相之间产生密度梯度，促进巨型单层囊泡或GUV沉降。

然后，将700微升200毫摩尔葡萄糖作为外溶液分配到腔室中。将足够的脂油混合物加入腔室中，直到60%至80%的腔室充满。在脂油混合物和外溶液之间将形成界面。

通过将ABP转移到肌动蛋白溶液中来制备肌动蛋白 - ABP混合物。然后，使用常规的100至1，000微升移液管将700微升的脂油混合物转移到肌动蛋白 - ABP混合物中。上下移液八次，生成直径为7至100微米的细胞大小的脂质单层乳液液滴。

使用相同的100至1， 000微升移液器将整个乳液分配到旋转室中。液滴将通过在油 - 外溶液界面处穿过脂质单层来获得第二个小叶，从而形成GUV。完成后，从搅拌板上取出腔室，并通过在废物容器中倾斜腔室来丢弃大部分脂油混合物。

通过将盖子朝内握住腔室，打开腔室盖并向内略微倾斜腔室。含有GUV的外部溶液与脂质油混合物之间的界面将从盖子所在的腔室开口处可见。使用移液器收集足够多的含有GUV的外部溶液，并将50至300微升外部溶液分配到96孔板中，以获得适当密度的GUV。

对于GUV的成像，将96孔板设置在配备油浸式60X物镜的倒置显微镜的载物台上。在图像处理软件 ImageJ Fiji 中打开感兴趣的图像序列，并识别具有最高强度的图像。按住 Control Shift C 以打开亮度和对比度窗口，然后单击重置选项卡。

在 ImageJ 斐济菜单中，转至分析和设置比例选项卡，输入每个图像像素的已知物理距离和单位。完成后，转到"图像"、"堆栈"，然后转到"3D 项目"按钮，以从 Z 堆栈重建 3D 图像。将"投影"方法设置为"亮度点"，将"切片间距"设置为 0.5 微米，然后选中"插值"框。

对其余设置使用默认选项并捕获图像。代表性图像显示了罗丹明PE标记的GUV的共聚焦图像，其包封的fascin-actin束。将肌动蛋白结合蛋白转移到肌动蛋白溶液中，然后加入脂油混合物并在几秒钟内产生脂质单层液滴，以避免在包封前形成肌动蛋白网络。

我们已经使用这种改进的cDICE技术来检查不同肌动蛋白网络交联剂在组织肌动蛋白网络中的作用。我们预计这种方法将有助于其他研究人员探索其他细胞骨架蛋白的调节。