测量成年小鼠急性纹状体切片中的耗氧率

我们开发了一种使用海马XF分析仪直接测量耗氧率的新方法。但线粒体功能的常见代理在成年小鼠的急性切片中。这种方法通过解剖学定义的大脑结构的穿刺能量学来测量细胞。

使用急性切片更接近地模仿生理细胞环境，这是无法实现分离线粒体或培养细胞的方式。这种方法将引起在帕金森病和亨廷顿舞蹈症领域工作的研究人员的广泛兴趣。首先，打开细胞外通量测定试剂盒，取出电极盒和实用板。

然后将传感器盒放在一边，不要触摸传感器。接下来，将600微升的校准溶液添加到实用板的每壁上。将传感器盒放在实用程序板的顶部，并将传感器浸入校准溶液中，确保实用程序和传感器盒板的三角形缺口正确对齐。

然后，用密封膜密封细胞外通量测定试剂盒，以防止校准溶液蒸发，然后将其置于未补充二氧化碳或氧气的37摄氏度培养箱中过夜。打开孔眼捕获微孔板，取出孔眼板进行组织坐下。然后在50毫升管中将适当体积的预氧改性人工脑脊液缓冲液加热至37摄氏度。

接下来将BSA加入到每毫升4毫克的最终浓度中以制备呼吸缓冲液。小心地向孔眼板的每个孔中加入625微升呼吸缓冲液，同时避免摇晃板，确保每个孔的缓冲液中没有气泡。立即在10毫升冰冷的预氧化切割液中解剖大脑。

然后，使用振动切片将冠状纹状体切片，按照制造商的说明在厚度为150微米的冰冷预氧切割液中进行。接下来，在50毫升含氧的人造脑脊髓液中回收切片。并在室温下将它们保存在溶液中长达30分钟。

恢复后，将切片转移到具有5毫米呼吸缓冲液的35×10毫米培养皿中。使用不锈钢活检冲头，通过轻轻按下冲头，同时将切片保持在缓冲液中，在切片大脑的所需区域创建一个圆形组织。然后取出组织的其余部分，将冲头抬起，并将圆形组织片取出到缓冲液中。

接下来，切开一毫升移液器吸头的最末端，形成一个直径为一点五到两点零毫米的孔，并用它来固定和转移打孔切片到捕获屏幕的顶部。抽取一块打孔的脑组织，并小心地将组织放在捕获屏幕的网状一侧，一块圆形塑料片，网状物附着在一侧。使用纸巾轻轻干燥捕获屏幕并除去水分，这会使组织变得粘稠并附着在网状物的中心。

接下来，用镊子将捕获屏幕切片面朝下，并将其放入孵化孔眼板的一个孔中。然后将孔眼板在37摄氏度的培养箱中孵育至少30分钟，以在运行测定之前允许温度和pH平衡。将所需的化合物和修饰的无BSA的人工脑脊液稀释至端口A至D的工作浓度的最终储备浓度。

通过将吸头以45度角将吸头以45度角置于注射口的中间，将75微升稀释的化合物轻轻预装到传感器盒的适当注射口中，因为完全插入可能导致化合物通过端口泄漏。然后，小心地从端口中取出吸头，不要产生气泡，并且不要点击墨盒的任何部分以避免缓解气泡。然后目视检查注射口是否均匀装载，确保所有液体都在端口中，并且墨盒顶部没有残留液滴。

将传感器墨盒放在实用板上后，将其放入培养箱中30分钟，使其升温至37摄氏度，同时只需抓住实用板并尽可能少地移动即可小心处理。首先在软件中加载测定模板，然后按绿色的开始按钮。然后将实用板上的传感器盒装入仪器托盘，确保板正确放置且平坦，将充满药物的传感器盒装入分析仪进行校准。

然后，按照屏幕上的说明进行校准。并平衡传感器。平衡步骤完成后，取出校准板并将其替换为包含网状和组织切片的孔眼板。

然后使用手稿中描述的测定方案测量板每个孔中的氧气消耗率。接下来，分析耗氧率测量数据和耦合效率数据。对照组不同厚度和冲孔尺寸切片的耗氧速率在整个测量过程中表现出稳定的基础呼吸，并与切片体积成正比。

此外，耗氧量相对稳定了五个小时，减少不到10%。比较了线粒体耦合效率，厚度为150 μ m，冲头尺寸为1.5 mm的切片显示出最高的耦合效率。测量了年轻和老年Pink1敲除组及其年龄匹配的野生型小鼠的耗氧率。

年轻小鼠的敲除组和野生型组的基础耗氧率相似。然而，对于老组中的敲除小鼠，它减少了。然而，在敲除小鼠中观察到年轻年龄组的线粒体功能障碍，由Pink1敲除引起的偶联效率降低表明。

该协议中的关键步骤包括准备脑切片，将它们转移到捕获屏幕的顶部，将载玻片放入孔中，并在测量过程中将它们附着在捕获屏幕上。