原代人鼻上皮细胞:精准医学背景下的生物样本库

该方案突出了扩增、分化和冷冻保存原代鼻上皮细胞的关键步骤。在我们的培养条件下，原代鼻上皮细胞模仿肺上皮细胞。这允许患者来源的培养物和来自新鲜或生物银行细胞的个性化医学研究。

患者来源的鼻上皮培养物可用于评估CFTR活性，并通过评估患者对新疗法的个体反应来帮助囊性纤维化治疗。演示该程序的将是来自我实验室的工程师Aurelie Hatton。首先，在10毫升扩增培养基中生长鼻上皮或HNE细胞。

在37摄氏度和5%二氧化碳下在75平方厘米的胶原蛋白包被烧瓶中孵育，直到达到80%至90%汇合度。每 48 到 72 小时更换一次培养基。之后，用10毫升镁和无钙DPBS洗涤细胞。

吸出并丢弃盐水。在加入两毫升0.25%胰蛋白酶并将烧瓶放回培养箱8至12分钟之前。之后，用手掌牢牢地敲击烧瓶，以帮助细胞脱离。

加入10毫升扩增培养基以停止酶促反应。使用10毫升移液管大力冲洗烧瓶，以在烧瓶表面拉出并排出扩增培养基，以冲洗和分离细胞并将细胞收集在15毫升管中。将细胞悬浮液以500倍G在4摄氏度下离心5分钟，然后弃去上清液。

将沉淀重新悬浮在5至10毫升的扩增培养基中。然后在血细胞计数器上计数细胞。细胞计数后，将细胞以500倍G在4摄氏度下离心5分钟，弃去上清液。

然后将沉淀重新悬浮在富集的冷冻培养基中，以获得每毫升10至6个细胞的三至五倍，并置于冷冻小瓶中。通过在零下80摄氏度的适当冷冻容器中将温度降低约一摄氏度/分钟来缓慢冷冻细胞。第二天，将保存的样品移至氮气储存容器中进行长期储存。

将新鲜制备的扩增培养基在设定为37摄氏度的水浴中加热。从氮气储存罐中取出冷冻小瓶，并迅速将其放入水浴中，注意不要将整个小瓶浸入水中。当只剩下一小滴冷冻液滴时，从水浴中取出冷冻小瓶。

用70%酒精擦拭小瓶，并将其放在引擎盖下。使用一毫升移液器，将解冻的细胞转移到15毫升管中。然后以逐滴方式加入一毫升温扩增培养基。

一分钟后，再加入一毫升扩增培养基，等待一分钟。加入10毫升扩增培养基，以500倍G离心2分钟，4摄氏度。吸出并丢弃上清液。

将沉淀重新悬浮在所需的扩增培养基中，以达到每毫升6个细胞的一倍10倍的细胞密度。将细胞接种到含有扩增培养基的25平方厘米胶原包被烧瓶上后，将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。如前所述，在进行细胞扩增之前，在两到三天内目视观察细胞扩张。

将细胞以3.3倍的密度接种在0.33平方厘米胶原包被的多孔过滤器上，每个过滤器10至第五个细胞的密度，在顶端侧补充300微升扩增培养基，在基底外侧补充900微升空气液体培养基。三天后，吸出顶端培养基，并在气液界面处培养细胞在气液培养基中三至四周，以建立分化的上皮。每48至72小时更换一次基础培养基。

在气液界面处培养的新鲜HNE细胞显示出极化和分化的呼吸道上皮的典型特征。在78个HNE细胞样本中，比较了立即接种的鼻刷和在冲洗培养基中运输一至七天后的成功率。成功培养的初始平均百分比为82%，在0至5天之间播种的样品中达到87%。

在新鲜条件下成功区分的样品中，83%在冷冻保存样品中也成功。同样，在新鲜条件下未能区分的样品中，71%在冻融条件下也未成功。此外，50%的样品在2到3倍之间冷冻，每个冷冻瓶的6个细胞在解冻时无法生长，对于低于2倍的10到6个细胞，达到80%。

对于在DMSO处理的HNE细胞中响应于毛喉素的短路电流变化和响应于CFTR抑制剂172的短路电流变化，在新鲜或冷冻解冻的HNE之间未观察到显着差异。在治疗后，两种细胞类型都显示出显着的校正，响应于毛喉素的短路电流变化增加以及响应于CFTR抑制剂172的短路电流变化的减少。与DMSO处理的HNE细胞相比，评估CFTR功能双重疗法的纠正反应，以响应毛喉素的短路电流变化，并且VX-809加VX-770和VX-661加VX-770显着改善了对CFTR抑制剂172的反应。

比较了来自6名F508del纯合子患者的HNE中的三种不同的CFTR调节剂疗法。当与CFTR校正器和增强器结合使用时，顶点和CFTR调制器，校正短路电流变化响应于毛喉素和短路电流变化，响应于CFTR抑制剂172达到类似程度。冷冻HNE细胞时，重要的是每个冷冻小瓶至少有300万个细胞，以增加解冻后获得良好结果的机会。

HNE细胞中的CFTR活性已被证明是评估和调整囊性纤维化个性化治疗的良好预测模型。