이 프로토콜은 일차 비강 상피 세포를 증폭, 분화 및 동결보존하기 위한 주요 단계를 강조합니다. 우리의 배양 조건에서, 원발성 비강 상피 세포는 폐 상피를 모방한다. 이를 통해 환자 유래 배양 및 신선한 또는 바이오 뱅크 세포에서 개인화 된 의학 연구가 가능합니다.
환자 유래 비강 상피 배양물을 사용하여 CFTR 활성을 평가하고 새로운 치료법에 대한 환자의 개별 반응을 평가함으로써 낭포성 섬유증 치료를 도울 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 엔지니어 인 Aurelie Hatton이 될 것입니다. 시작하려면 비강 상피 또는 HNE 세포를 10 밀리리터의 증폭 배지에서 성장시킵니다.
섭씨 37도 및 5% 이산화탄소가 80 내지 90%컨플루언시에 도달할 때까지 75 평방 센티미터의 콜라겐 코팅 플라스크에서 인큐베이션한다. 48~72시간마다 배지를 교체하십시오. 나중에 10 밀리리터의 마그네슘과 칼슘이없는 DPBS로 세포를 씻으십시오.
염분을 흡인하고 버리십시오. 0.25 % 트립신 2 밀리리터를 첨가하고 플라스크를 8 ~ 12 분 동안 인큐베이터로 반환하기 전에. 나중에 플라스크를 손바닥으로 단단히 두드려 세포 분리를 돕습니다.
효소 반응을 멈추기 위해 증폭 배지 10 밀리리터를 첨가한다. 10 밀리리터 피펫을 사용하여 플라스크를 격렬하게 헹구고 플라스크 표면 위로 증폭 배지를 뽑아 내고 배출하여 세포를 헹구고 분리하고 세포를 15 밀리리터 튜브에 수집하십시오. 세포 현탁액을 섭씨 네 도에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리하고 상층액을 버린다.
펠렛을 다섯 내지 10밀리리터의 증폭 배지에 재현탁시킨다. 그런 다음 혈구 측정기에서 세포를 계산하십시오. 세포 계수 후, 세포를 섭씨 네 도에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리하고 상층액을 버린다.
그 후 펠렛을 농축된 동결 배지에 재현탁시켜 밀리리터 당 여섯 개의 세포를 10회 내지 세 번 내지 다섯 번 수득하고 냉동 바이알에 놓는다. 영하 80도의 적절한 냉동 냉동 용기에서 분당 약 섭씨 한 도만큼 온도를 낮춤으로써 세포를 천천히 동결시킵니다. 다음 날, 보존된 샘플을 장기 보관을 위해 질소 저장 용기로 옮깁니다.
갓 준비한 증폭 배지를 섭씨 37도로 설정된 수조에서 따뜻하게 합니다. 질소 저장 탱크에서 냉동 바이알을 제거하고 신속하게 수조에 넣고 바이알 전체를 물에 담그지 않도록주의하십시오. 작은 얼어 붙은 물방울 만 남을 때 수조에서 냉동 바이알을 제거하십시오.
바이알을 70 % 알코올로 닦아 후드 아래에 놓습니다. 1 밀리리터 피펫을 사용하여 해동 된 세포를 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 한 밀리리터의 따뜻한 증폭 배지를 드롭 와이즈 방식으로 첨가하십시오.
잠시 후 증폭 배지 한 밀리리터를 더 넣고 잠시 기다립니다. 증폭 배지 10 밀리리터를 넣고 섭씨 네 도에서 두 분 동안 500 배 G에서 원심 분리하십시오. 상층액을 흡인하고 버립니다.
펠렛을 밀리리터 당 1회 10 내지 여섯 개의 세포의 세포 밀도를 달성하기 위해 요구되는 증폭 배지의 부피에 재현탁시킨다. 세포를 증폭 배지를 함유하는 25 평방 센티미터의 콜라겐 코팅 플라스크 상에 시딩한 후, 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션한다. 앞서 입증된 바와 같이 세포 증폭을 수행하기 전에 이삼일에 걸친 세포 확장을 육안으로 관찰한다.
세포를 0.33 평방 센티미터 콜라겐 코팅 다공성 필터에 필터 당 3.3 배 10 내지 5 번째 세포의 밀도로 시드하고, 정점 측에서 300 마이크로리터의 증폭 배지와 기저측에서 900 마이크로리터의 공기 액체 배지로 보충한다. 사흘 후, 정점 배지를 흡인하고 세포를 공기-액체 배지에서 삼 내지 사주 동안 공기-액체 계면에서 배양하여 분화된 상피를 확립한다. 48 ~ 72 시간마다 기본 배지를 교체하십시오.
공기-액체 계면에서 배양된 신선한 HNE 세포는 편광되고 분화된 호흡 상피의 전형적인 특징을 나타내었다. 78개의 HNE 세포 샘플에서, 성공률은 플러싱 배지에서 운반 즉시 및 운반 후 즉시 시딩된 비강 양치에서 비교되었다. 성공적인 배양의 초기 평균 비율은 82 %였으며 0에서 5 일 사이에 시드 된 샘플에서 87 %에 도달했습니다.
신선한 조건에서 성공적으로 분화된 샘플의 83%는 또한 동결보존된 샘플에서 성공적이었다. 마찬가지로, 신선한 조건에서 분화하지 못한 샘플에서 71 %는 동결 해동 조건에서도 실패했습니다. 더욱이, 냉동 바이알 당 10 내지 6개의 세포 사이에서 두 내지 세 번 사이에 동결된 샘플의 50%는 해동될 때 성장하지 못하여, 6개의 세포에 대해 두 번 10회 미만으로 80%에 도달하였다.
DMSO 처리된 HNE 세포에서 CFTR 억제제(172)에 반응하는 포스콜린 및 단락 전류 변화에 반응하는 단락 전류 변화에 대해, 신선 또는 냉동 해동된 HNE 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 치료 시, 두 세포 유형 모두 포스콜린에 대한 반응의 단락 전류 변화의 증가와 CFTR 억제제 172에 대한 반응의 단락 전류 변화의 감소와 함께 상당한 보정을 나타냈다. CFTR 기능 이중 요법의 시정 반응은 포스콜린에 대한 반응에서 DMSO 처리된 HNE 세포 단락 전류 변화와 비교하여 평가되었고, CFTR 억제제 172에 대한 반응으로 VX-809 플러스 VX-770 및 VX-661 플러스 VX-770 둘 다에 의해 유의하게 개선되었다.
6명의 F508del 동형접합성 환자로부터의 HNE에서 세 가지 상이한 CFTR 조절제 요법을 비교하였다. CFTR 보정기 및 전위제, 정점 및 CFTR 변조기 둘 다와 함께 사용될 때, CFTR 억제제(172)에 반응하여 포스콜린 및 단락 전류 변화에 응답하여 단락 전류 변화를 유사한 정도로 보정한다. HNE 세포를 동결시킬 때, 해동 시 좋은 결과를 얻을 가능성을 높이기 위해 냉동 바이알 당 적어도 3백만 개의 세포를 보유하는 것이 중요하다.
HNE 세포에서의 CFTR 활성은 낭포성 섬유증에서 개인화된 치료법을 평가하고 조정하는데 좋은 예측 모델인 것으로 나타났다.
