פרוטוקול זה מדגיש את שלבי המפתח להגברה, התמיינות והקפאה של תאי אפיתל האף הראשוניים. בתנאי התרבית שלנו, תאי אפיתל האף הראשוניים מחקים את אפיתל הריאה. זה מאפשר תרביות שמקורן בחולה ומחקרי רפואה מותאמת אישית מתאים טריים או ביו-בנקאיים.
ניתן להשתמש בתרביות אפיתל האף שמקורן בחולה כדי להעריך את פעילות ה-CFTR ולסייע בטיפול בסיסטיק פיברוזיס על ידי הערכת התגובה האישית של המטופל לטיפולים חדשים. מי שידגים את ההליך יהיה אורלי האטון, מהנדס מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לגדל אפיתל האף או תאי HNE, ב 10 מיליליטרים של מדיום הגברה.
דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני בבקבוקון מצופה קולגן בגודל 75 סנטימטרים רבועים עד שתגיע ל-80 עד 90% מפגש. החלף את המדיום כל 48 עד 72 שעות. מאוחר יותר, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטרים של מגנזיום ו DPBS ללא סידן.
לשאוף ולהשליך את המלח. לפני הוספת שני מיליליטרים של 0.25% טריפסין והחזרת הבקבוקון לחממה למשך שמונה עד 12 דקות. מאוחר יותר, הקש על הבקבוקון בחוזקה עם כף יד כדי לסייע בניתוק התאים.
הוסף 10 מיליליטרים של מדיום ההגברה כדי לעצור את התגובה האנזימטית. לשטוף במרץ את הבקבוקון באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר כדי למשוך ולגרש את מדיום ההגברה מעל משטח הבקבוק כדי לשטוף ולנתק תאים ולאסוף את התאים בצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-500 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנאטנט.
להשעות מחדש את הכדור בחמישה עד 10 מיליליטרים של מדיום הגברה. לאחר מכן ספרו את התאים על המוציטומטר. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה של התאים ב-500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנאטנט.
לאחר מכן יש להשעות מחדש את הכדור במדיום ההקפאה המועשר כדי להשיג שלוש עד חמש פעמים 10 עד ששת התאים למיליליטר ולהניח בבקבוקון קריו. להקפיא באיטיות את התאים על ידי הפחתת הטמפרטורה בערך מעלה אחת צלזיוס לדקה במיכל קריופריזציה מתאים במינוס 80 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הדגימה המשומרת למיכל אחסון חנקן לאחסון לטווח ארוך.
מחממים את מדיום ההגברה הטרי שהוכן באמבטיית מים שנקבעה ל-37 מעלות צלזיוס. מוציאים בקבוקוני קריו ממיכל אגירת החנקן ומניחים אותם במהירות באמבט המים, תוך הקפדה שלא להטביע את כל הבקבוקון במים. הסר את בקבוקוני הקריו מאמבטיית המים כאשר נותרה רק טיפה קפואה קטנה.
נגבו את הבקבוקונים ב-70% אלכוהול והניחו אותם מתחת למכסה המנוע. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, מעבירים את התאים המופשרים לצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום הגברה חמה בצורה טיפתית.
אחרי דקה אחת, מוסיפים עוד מיליליטר אחד של מדיום הגברה ומחכים דקה. הוסיפו 10 מיליליטרים של מדיום הגברה וצנטריפוגה ב-500 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשאוף ולהשליך את ה-supernatant.
השעיה מחדש את הכדור בנפח של מדיום הגברה הנדרש כדי להשיג צפיפות תאים של פי 10 עד ששת התאים למיליליטר. לאחר זריעת התאים על בקבוק קולגן מצופה קולגן בגודל 25 סנטימטרים רבועים, המכילים מדיום הגברה, דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. יש לבחון באופן חזותי את התפשטות התא במשך יומיים עד שלושה לפני ביצוע הגברה של התאים, כפי שהודגם קודם לכן.
זרעו את התאים בצפיפות של 3.3 כפול 10 לתאים החמישיים לכל מסנן על פילטר של 0.33 סנטימטרים רבועים של קולגן מצופה מסננים נקבוביים, בתוספת 300 מיקרוליטרים של מדיום הגברה בצד האפיקלי ו-900 מיקרוליטרים של מדיום נוזלי אוויר בצד הבזולטרלי. לאחר שלושה ימים, שאפו למדיום האפיקלי ותרבו את התאים בממשק אוויר-נוזל במשך שלושה עד ארבעה שבועות בתווך האוויר-נוזלי כדי ליצור אפיתל ממוין. שנה את המדיום הבסיסי כל 48 עד 72 שעות.
תאי HNE טריים בתרבית בממשק אוויר-נוזל הציגו תכונות אופייניות של האפיתל הנשימתי המקוטב והמובחן. ב-78 דגימות תאי HNE, שיעורי ההצלחה הושוו בצחצוח האף שנזרע מיד ולאחר יום עד שבעה ימי הובלה במדיום שטיפה. האחוז הממוצע הראשוני של תרביות מוצלחות היה 82% והגיע ל-87% בדגימות שנזרעו בין אפס לחמישה ימים.
83% מהדגימות שהתבלטו בהצלחה בתנאים חדשים הצליחו גם בדגימות בהקפאה. באופן דומה, בדגימות שלא הצליחו להתמיין בתנאים חדשים, 71% גם לא הצליחו בתנאי הפשרה בהקפאה. יתר על כן, 50% מהדגימות שהוקפאו בין פי שניים עד שלושה פעמים 10 עד ששת התאים לכל בקבוקון קריו לא הצליחו לגדול בעת ההפשרה, והגיעו ל -80% בפחות מפי שניים 10 לששת התאים.
עבור שינוי בזרם קצר בתגובה לפורסקולין ושינוי בזרם קצר בתגובה למעכב CFTR 172 בתאי HNE שטופלו ב-DMSO, לא נצפה הבדל משמעותי בין HNE מופשר טרי או קפוא. עם הטיפול, שני סוגי התאים הראו תיקון משמעותי עם עלייה בשינוי זרם קצר בתגובה לפורסקולין וירידה בשינוי זרם קצר חשמלי בתגובה למעכב CFTR 172. התגובה המתקנת של טיפולים כפולים בתפקוד CFTR הוערכו בהשוואה לתאי HNE שטופלו ב-DMSO שינוי זרם קצר חשמלי בתגובה לפורסקולין ובתגובה למעכב CFTR 172 שופרו באופן משמעותי הן על ידי VX-809 והן על ידי VX-770, והן על ידי VX-661 בתוספת VX-770.
הושוו שלושה טיפולים שונים במודולטור CFTR ב-HNE משישה חולים הומוזיגוטיים מסוג F508del. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם מתקן CFTR ופוטנציאטור, הן קודקוד והן אפנן CFTR, תיקנו את שינוי זרם המעגל הקצר בתגובה לשינוי בזרם פורסקולין וקצר חשמלי בתגובה למעכב CFTR 172 במידה דומה. בעת הקפאת תאי HNE, חשוב שיהיו לפחות 3 מיליון תאים לכל בקבוקון קריו כדי להגדיל את הסיכויים לתוצאה טובה בעת ההפשרה.
פעילות CFTR בתאי HNE הוכחה כמודל ניבוי טוב להערכה והתאמה של טיפולים מותאמים אישית בסיסטיק פיברוזיס.
