Bu protokol, primer nazal epitel hücrelerinin çoğaltılması, farklılaştırılması ve kriyopreservasyonunun temel adımlarını vurgulamaktadır. Kültür koşullarımızda primer nazal epitel hücreleri akciğer epitelini taklit eder. Bu, hasta kaynaklı kültürlere ve taze veya biyobankalı hücrelerden kişiselleştirilmiş tıp çalışmalarına izin verir.
Hasta kaynaklı nazal epitel kültürleri, KFTR aktivitesini değerlendirmek ve hastanın yeni tedavilere bireysel yanıtını değerlendirerek kistik fibroz tedavisine yardımcı olmak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir mühendis olan Aurelie Hatton olacak. Başlamak için, 10 mililitre amplifikasyon ortamında nazal epitel veya HNE hücrelerini büyütün.
75 santimetrekarelik kollajen kaplı bir şişede% 80 ila% 90 akıcılığa ulaşana kadar 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ortamı her 48 ila 72 saatte bir değiştirin. Daha sonra, hücreleri 10 mililitre magnezyum ve kalsiyum içermeyen DPBS ile yıkayın.
Tuzlu suyu aspire edin ve atın. İki mililitre% 0.25 tripsin eklemeden ve şişeyi sekiz ila 12 dakika boyunca inkübatöre geri döndürmeden önce. Daha sonra, hücrenin ayrılmasına yardımcı olmak için şişeye bir avuç içi ile sıkıca dokunun.
Enzimatik reaksiyonu durdurmak için amplifikasyon ortamının 10 mililitresini ekleyin. Hücreleri durulamak ve ayırmak ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplamak için amplifikasyon ortamını şişe yüzeyine çekmek ve dışarı atmak için şişeyi 10 mililitrelik bir pipet kullanarak kuvvetlice durulayın. Hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
Peleti beş ila 10 mililitre amplifikasyon ortamında tekrar askıya alın. Sonra bir hemositometredeki hücreleri sayın. Hücre sayımından sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.
Daha sonra, mililitre başına altı hücreye üç ila beş kez 10 elde etmek ve bir kriyo şişesine yerleştirmek için peleti zenginleştirilmiş dondurucu ortamda tekrar askıya alın. Sıcaklığı dakikada yaklaşık bir santigrat derece düşürerek hücreleri eksi 80 santigrat derecede uygun bir kriyodondurucu kapta yavaşça dondurun. Ertesi gün, uzun süreli depolama için korunan numuneyi bir azot depolama kabına taşıyın.
Taze hazırlanmış amplifikasyon ortamını 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda ısıtın. Kriyotik şişeleri azot depolama tankından çıkarın ve tüm şişeyi suya batırmamaya dikkat ederek hızlı bir şekilde su banyosuna yerleştirin. Sadece küçük bir donmuş damlacık kaldığında kriyo şişelerini su banyosundan çıkarın.
Şişeleri% 70 alkol ile silin ve kaputun altına yerleştirin. Bir mililitrelik pipet kullanarak, çözülmüş hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, damla yönünde bir mililitre ılık amplifikasyon ortamı ekleyin.
Bir dakika sonra, bir mililitre amplifikasyon ortamı daha ekleyin ve bir dakika bekleyin. 10 mililitre amplifikasyon ortamı ekleyin ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın. Süper natantı aspire edin ve atın.
Pelet, mililitre başına altı hücreye bir kez 10 hücre yoğunluğu elde etmek için gereken bir amplifikasyon ortamı hacminde yeniden askıya alın. Hücreleri, amplifikasyon ortamı içeren 25 santimetrekarelik kollajen kaplı bir şişeye tohumladıktan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha önce gösterildiği gibi hücre amplifikasyonunu gerçekleştirmeden önce iki ila üç gün boyunca hücre genişlemesini görsel olarak gözlemleyin.
Hücreleri filtre başına 3.3 kat 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda, apikal tarafta 300 mikrolitre amplifikasyon ortamı ve bazolateral tarafta 900 mikrolitre hava sıvı ortamı ile desteklenmiş 0.33 santimetrekare kollajen kaplı gözenekli filtrelerde tohumlayın. Üç gün sonra, apikal ortamı aspire edin ve farklılaşmış bir epitel oluşturmak için hava-sıvı ortamındaki hücreleri hava-sıvı ortamında üç ila dört hafta boyunca kültürleyin. Bazal ortamı her 48 ila 72 saatte bir değiştirin.
Hava-sıvı arayüzünde kültürlenen taze HNE hücreleri, polarize ve farklılaşmış solunum epitelinin tipik bir özelliğini sergiledi. 78 HNE hücre örneğinde, hemen ve bir ila yedi günlük bir yıkama ortamında taşındıktan sonra tohumlanan burun fırçalamada başarı oranları karşılaştırıldı. Başarılı kültürlerin ilk ortalama yüzdesi% 82 idi ve sıfır ila beş gün arasında tohumlanan örneklerde% 87'ye ulaştı.
Taze koşullarda başarılı bir şekilde farklılaşan örneklerin %83'ü kriyokorunmuş örneklerde de başarılı olmuştur. Benzer şekilde, taze koşullarda farklılaşamayan örneklerde,% 71'i donma-çözülme koşullarında da başarısız olmuştur. Dahası, kriyo şişe başına altı hücreye iki ila üç kez 10 arasında dondurulmuş örneklerin% 50'si çözüldüğünde büyüyemedi ve altı hücreye iki kez 10'un altında% 80'e ulaştı.
Forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişimi ve DMSO ile muamele edilmiş HNE hücrelerinde CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak kısa devre akımı değişimi için, taze veya dondurulmuş çözülmüş HNE arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Tedavi üzerine, her iki hücre tipi de forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişiminde bir artış ve CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak kısa devre akımı değişiminde bir azalma ile önemli bir düzeltme göstermiştir. CFTR fonksiyonlu ikili tedavilerin düzeltici yanıtı, DMSO ile tedavi edilen HNE hücrelerinin forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişimine kıyasla değerlendirildi ve CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak hem VX-809 artı VX-770 hem de VX-661 artı VX-770 ile anlamlı derecede iyileşti.
HNE'de altı F508del homozigot hastadan üç farklı CFTR modülatör tedavisi karşılaştırıldı. Bir CFTR düzeltici ve güçlendirici, hem köşe hem de CFTR modülatörleri ile birlikte kullanıldığında, forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişimini ve CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak kısa devre akımı değişimini benzer ölçüde düzeltir. HNE hücrelerini dondururken, çözülme üzerine iyi bir sonuç alma şansını artırmak için kriyo şişe başına en az 3 milyon hücreye sahip olmak önemlidir.
HNE hücrelerinde CFTR aktivitesinin, kistik fibrozda kişiselleştirilmiş tedavileri değerlendirmek ve ayarlamak için iyi bir prediktif model olduğu gösterilmiştir.
