活体成像使我们能够观察肿瘤微环境中的生理相互作用。通过使用这种方法，可以使用局部组织特征来划分观察到的特定动态行为。该协议仅使用来自胶原纤维或自发荧光代谢物的无处不在的无标记信号来分割TME，从而最大限度地减少对小鼠的操作量。
该方法广泛适用于任何需要了解相对于细胞外基质结构或血管结构的动态相互作用的活体内系统。演示这一程序的将是高级研究专家Dave Inman和实验室研究生Erica Hoffmann。通过将1.5 12毫米圆形盖板玻璃浸泡在100%乙醇中10分钟，然后用加热灯干燥盖板玻璃并使用氰基丙烯酸酯粘合剂将玻璃固定在金属乳腺成像窗框上，开始制备乳腺成像窗盖玻璃。
在一夜之间固化粘合剂。第二天，使用丙酮浸泡的拭子清洁组装的乳房成像窗口的多余粘合剂，然后将乳房成像窗口浸入70%乙醇中至少10分钟，以协助清洁。干燥后，将清洁的乳腺成像窗口存放在无菌培养皿中。
在开始手术之前，先用70%乙醇高压灭菌手术工具并对表面进行消毒。为手术准备一个经过消毒的桌面，用覆盖着无菌田的温暖毯子。设置加热毯，使无菌场顶部测量的温度为40摄氏度。
使用辅助冷光和放大镜进行外科手术。穿戴由无菌一次性实验室外套、手术套、手套、护目镜和口罩组成的PPE。接下来，用脱毛膏去除第四腹股沟乳腺处麻醉小鼠的皮毛，并用无菌水浸泡的纱布冲洗手术部位。
然后用三种交替的Betadine和乙醇磨砂膏对皮肤表面进行消毒，准备脱毛的手术部位进行手术。完成后，使用镊子轻轻地将皮肤抬高到乳腺上。一旦皮肤被拉离体壁，用手术微剪刀去除镊子尖端的一毫米真皮层。
在不切割下层腺体的情况下，创建一个10毫米的切口，然后通过镊子的轻柔运动将乳腺从真皮层中释放出来。添加PBS以覆盖暴露的腺体。使用5-0丝编织缝合线沿开口的外围形成钱包串缝合线，然后插入乳腺成像窗口的边缘，使真皮层啮合到乳腺成像窗口的接收凹口中。
在拉伸乳腺成像窗口另一端的上皮的同时，将金属乳腺成像窗口推入到位，使得真皮层完全啮合整个乳腺成像窗口周周围的接收槽口。然后捏紧钱包绳子，将真皮层拉入缺口，并系上层以固定窗户。在乳腺成像窗口的真皮层上应用局部抗生素并持续监测小鼠。
在恢复足够的意识以维持胸骨卧位后，将乳房成像窗口将小鼠单独植入柔软的床上用品上，并将冰屋放置在笼子中，并允许小鼠在成像前恢复48小时。对于成像，请使用设置为30摄氏度的强制空气系统。使用额外的物镜加热器以避免Z轴焦点漂移，并允许系统在成像前至少一小时在30摄氏度下达到平衡。
然后在显微镜载物台上设置加热室。用脚趾捏方法确认麻醉后，向小鼠添加眼药膏。为了保持适当的水合作用，在成像过程中，每两小时皮下注射0.5毫升PBS。
将水基凝胶而不是水涂在物镜上，并在将小鼠转移到预热的显微镜载物台之前，用棉花施用器和玻璃清洁剂清洁乳腺成像窗口玻璃的外部。将小鼠放在显微镜载物台上后，将乳腺成像窗口的项圈按入载物台插入物台插入物中的14毫米接收孔中，以稳定图像并适合异氟醚软管。然后使用显微镜眼部和明场照明将成像场聚焦，观察脉管系统的血流。
检查视野的稳定性。如果存在呼吸运动伪影，请用小泡沫块和类似铍子的胶带轻轻按压压腺的背面。施加按压后，验证整个视野中的血流是否保持。
一旦小鼠被镇静并牢固地定位在倒置的显微镜载物台上，开始定位感兴趣的区域。使用指向乳腺成像窗口的光源，使用显微镜的目镜确定潜在的调查区域。重点应该是观察脉管系统和血流。
在软件中添加并保存 XY 位置。当设置适当的功率水平时，设置Z堆栈，并在乳腺成像窗口玻璃表面下方20至50微米处观察丰富的胶原纤维的外观。随着显微镜进入肿瘤的更深处，胶原蛋白将变得不那么普遍。
二次谐波生成或SHG中的空隙揭示了肿瘤肿块的位置。将顶部的Z切片置于孤立细胞层下方，第一个胶原纤维出现在50至100微米处。将底部Z切片设置为250微米，其中光纤淡出并且信号较差占主导地位。
然后对所有保存的XY位置重复该过程。设置 Z 轴堆栈范围后，将停留时间增加到 8 微秒，并优化功率和检测器设置。优化激发每个实验组织所需的功率水平，并在物镜后孔径下使用高达90毫瓦的750纳米或890纳米时高达70毫瓦的功率。
接下来，从大多数活体内迁移胶片的收集点之间的10分钟间隔开始，并根据实验目标调整时间间隔。如果观察到光毒性迹象，如细胞漂白或快速增加的自发荧光和过度的光漂白，请根据条件指示降低激光功率或增加延时间隔。对于NADPH的荧光寿命成像或FLIM，开始预览扫描并调整激光功率，直到恒定分数鉴别器或CFD的读数介于10到第五到10到第六之间。
超过CFD超过10到第六会导致光子堆积和整体结果不佳。设置功率电平后，将积分时间设置在90到120秒之间，然后启动FLIM集合，在分配的时间内从视野中获取光子。无标记乳腺肿瘤内的典型视野显示，窗口附近有大量的胶原纤维，肿瘤深处的丰度降低。
荧光寿命或NADPH的使用有助于识别脉管系统。图像中的一些黑暗区域是肿瘤褶皱或相邻肿瘤叶的对接。为了鉴定脉管系统，通过比较尾静脉注射荧光葡聚糖之前和之后的活体内堆栈的最大强度投影，验证了使用NDPH FLIM的复合图像。
代表性分析显示了四只小鼠和视野的量化。为了描绘无标记肿瘤肿块的边界，使用NADPH自发荧光。这些图像报告了细胞的代谢特征和血管的位置。
AFD自发荧光也识别出巨噬细胞。通过分割方案，仅使用SHG和NADPH自发荧光将无标记肿瘤分割成肿瘤巢，基质和脉管系统的区室。此外，基质和胶原纤维也可以分为排列纤维的局部区域。
对于该协议，要记住的最重要的事情是确保鼠标得到适当的镇静和抑制，以便视野在成像时保持稳定。
