利用生命内成像和固定组织分析评估与癌细胞传播相关的转移门道介导血管渗透性的肿瘤微环境

这些互补技术使用高分子量 Dextran 评估和测量肿瘤血管的渗透性。固定组织协议提供更大的肿瘤覆盖率，高吞吐量，不需要多光子成像设备。另一方面，病毒内成像协议提供有关转移或TMEM肿瘤微环境中细胞动力学、功能和动态相互作用的实时信息。

因此，这里提出的协议能够直接测量TMEM依赖性血管渗透性，这与癌细胞传播有强烈关系，因此这些协议可用于评估肿瘤的转移电位。要生成适合移植的肿瘤组织片段，请从文本协议中描述的带肿瘤小鼠的安乐死开始。将带DMEM/F12细胞培养培养基的培养皿放在烟罩的冰上。

将鼠标带到烟罩，用70%乙醇对小鼠腹部进行消毒。使用无菌手套和手术工具，切除肿瘤，并将其放入培养皿中。将肿瘤切成小块，丢弃任何坏死部分，而他们是在培养皿。

为了将肿瘤片段移植到接受者宿主体内，麻醉小鼠，如文本协议所述，这些小鼠用基因工程、荧光标记的巨噬细胞长大。将麻醉量降低至约3%异氟烷，并涂抹在小鼠眼睛的眼科软膏，以防止干燥。从鼠标的第四个乳腺上去除头发。

用防腐剂清洁皮肤后，使用消毒仪器制作一个小切口，切口大约两到三毫米，只低于第四个奶嘴。解剖，直到乳腺脂肪垫暴露。从培养皿中拿一块肿瘤，用人造细胞外基质涂上外衣。

移植肿瘤下的第四乳腺脂肪垫。使用氰丙烯酸酯粘合剂关闭切口。最后，在动物的饮用水中加入一毫升的苯丙沙星抗生素。

麻醉鼠标，并插入尾静脉导管，如文本协议中所述。使纵向中线切口立即开始优于生殖器，并携带切口到第四乳腺的上级水平。将切口横向进行到第四乳腺的优越方面。

在这一点上，避免损害血液供应至关重要。将一小块硬橡胶（尺寸为两厘米）贴在皮瓣的皮瓣上，以稳定皮肤活门。肿瘤应该位于橡胶稳定区域的中心。

将小薄膜的氰丙烯酸酯涂抹到定制成像窗框的外缘上。现在，在盖玻璃的中心涂抹一小滴 PBS。避免窗框上的氰丙烯酸酯与玻璃上的PBS接触，避免氰丙烯酸酯过早聚合。

用实验室擦拭擦干周围的皮瓣组织。将小成像窗口贴在组织皮瓣上，肿瘤位于透明孔径的中心。将麻醉小鼠和尾静脉导管转移到显微镜阶段。

使用极其小心，确保尾静脉导管不会脱落。此时，执行文本协议和我们之前的 JoVE 出版物中描述的长期病毒内成像。要进行更高的通量分析和更大的肿瘤覆盖率，请使用固定组织中的免疫荧光来评估TMEM培养的血管渗透性。

要进行免疫荧光染色，首先准备文本协议中描述的样品，然后加热浸在柠檬酸盐中靠近沸点的部分20分钟，以进行抗原检索。让样品冷却至室温15至20分钟后，在PBS中清洗样品三次，每次洗涤两分钟。阻断60至90分钟的阻断缓冲液，然后用原生大鼠和快速抗体的混合物孵育样品，分别针对内莫素和四甲苯二胺。

孵育后，在PBST中清洗样品三次，每次两分钟。用二次驴抗体对Rat IgG和快速IgG的混合物孵育样品，然后在PBST中清洗样品三次，每次两分钟。使用无甘油硬安装介质进行常规 DAPI 染色和安装幻灯片。

将样品存放在黑暗的地方，直到扫描。为了获得最佳效果，请扫描数字全幻灯片扫描仪上的幻灯片。要执行图像分析，请使用任何适合数字病理学的软件，每个案例捕获 10 个高功率场。

将内向明素和 TMR 通道分别保存为 TIFF。使用 ImageJ，上传 TIFF 文件并将其转换为 8 位图像。将 8 位图像阈值到负控级别，并生成两个显示内向素和 TMR 蒙版的二进制图像。

从二进制工具中，选择内向膜面上的填充孔。生成阈值的 Dextran 映像，并将其保存为 Dextran ROI。此外，生成阈值内莫素图像，将其保存为血管 ROI，并生成倒置内等素图像，并保存为血管外 ROI。

接下来生成相交的血管外 ROI 和 Dextran ROI 图像，并将其保存为血管外投资回报率。最后将整个图像保存为肿瘤 ROI。将血管外德克斯特兰 ROI 区域除以 Tumor ROI 区域，再乘以 100，生成外血管 Dextran 覆盖整个肿瘤的百分比区域。

对每个案例的 10 到 20 个高功率场重复此过程，并生成每个案例的平均血管外 Dextran。这里展示的是转基因动物中一个健康、发育中的乳腺的图像。血管由TMR Dextran以红色标记，乳腺延展性上皮由绿色荧光蛋白dendra2标记，巨噬细胞由青色荧光蛋白标记。

相比之下，移植的登德拉2标记的侵入性延展癌显示在一种标有巨噬细胞和血管的动物中。健康的肺组织通过小鼠内有标记血管的肺成像窗口进行可视化。肺转移是明显的后，注射肿瘤细胞到转基因动物与标记巨噬细胞和血管。

这里展示的仍然是高分子量 Dextran 标记的新血管在移植的 dendra2 标记的乳房侵入性癌中的时间失效的病毒内成像电影。虚线表示泄漏事件之前、期间和之后瞬态血管泄漏区域的轮廓。TMEM 门在实时成像中捕获。

多通道免疫荧光显示内分素，高分子量Dextran，其合并图像以及DAPI，以及相应的阈值血管和血管外德克斯特兰口罩。同时显示了TMEM免疫组织化学的相应顺序部分。远离 TMEM 的血管轮廓显示为非泄漏血管轮廓，而 TMEM 相关的血管轮廓显示为泄漏的血管轮廓。

在肿瘤的手术暴露过程中，避免切割供应肿瘤的血管是非常重要的。此处描述的方法可以与药物治疗相结合，同样可以抑制TMEM功能，防止血管渗透，甚至使肿瘤血管正常化，以测量其影响和疗效。通过此协议，我们之前已经证明化疗可增强血管渗透性和癌细胞传播，实际上，通过联合管理TMEM功能抑制剂可以规避这些亲转移性变化。